1. 使用三重四级杆质谱进行蛋白药物定量的方法开发流程

使用质谱进行蛋白药物定量，在方法开发时主要考虑样品前处理和质谱方法两个主要方面。在前处理方面我们使用了去垢剂辅助沉淀酶解的方法来获得更佳的酶解效率和更低的基质效应，具体步骤如图1a所示。蛋白类药物质谱定量时一般采用bottom-up的策略，因此整个质谱方法的开发主要包括候选肽段挑选，质谱参数优化（Compound Optimization）和离子对精简（Re­nement）三个步骤（图1b）。

● 候选肽段挑选

一般来说，我们挑选的候选肽段需要满足以下条件: (1) 该肽段在基质样品不存在*相同的序列，在实际工作中，这一步通常需要放到最后的re­nement步骤完成评估。(2) 肽段的长度在7-20个氨基酸为宜, 太短的肽段特异性较差，而太长的肽段通常色谱质谱行为不佳，给方法开发带来困难。(3) 没有漏切位点。(4) 不含M, C, KP/RP, HxS/T等氨基酸或者一致序列。(5) 该肽段质谱响应高。由于三重四级杆质谱仪不具备数据依赖采集（Data-dependent Acquisition, DDA）的功能来对蛋白药物进行肽图分析，因此在进行候选肽段挑选时通常依赖于软件预测的方法[8]。然而软件预测通常效率不可控，因此通常需要产生较多的候选肽段来进行后续的化合物优化和re­nement步骤，从而增加了方法开发的时间。

而在实验室拥有高分辨质谱的情况下，我们可以大大简化这一步骤。我们将目标单抗掺入BSA基质进行酶解，随后采用Orbitrap质谱仪进行DDA的数据采集，生成的数据使用Proteome

DiscovererTM (PD) 2.3进行非标记定量（Label Free Quanti_cation, LFQ）分析，可以轻松的找到强度最高的肽段（图1b）。随后我们仅需选出不含漏切位点，不含M, C, KP/RP, HxS/T且长度合适的肽段即可。采用Orbitrap进行LFQ分析后，我们不仅可以获得肽段的强度信息（图2a, 2b），还

可以获得每条肽段的注释二级谱，帮助我们在挑选离子对时排除掉一些诸如中性丢失等选择性差的离子对（图2c）。

为了帮助我们在定量单抗药物时更好的监控药物在体内的结构完整性，我们在单抗恒定区的四个主要结构域均挑选了2-3条候选肽段来进行后面的优化和精选（图3）。LSP2，HSP2和HSP8三条候选肽段均含有半胱氨酸残基（图3b,3c），在IAA处理后会形成烷基化的固定修饰，理论上不适合作为定量肽段，但为了保证每个结构域均有肽段能够参与定量，我们依旧在优化和精选步骤将中它们计入考察。

• 赛默飞TSQAltis™三重四级杆质谱仪

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