核酸分子杂交的概念、基本原理、探针及类型2016/01/05

主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA变性：1、DNA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。（二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecularhybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。二、分子杂交基本原理：（一）DN

转座子标签法克隆基因的改进2015/12/31

1转座子及转座子标签法克隆基因基因标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法，T-DNA和转座子均可作为基因标签。转座子zui早由美国的细胞遗传学家Mc-clintock在玉米中发现，它是指基因组中一段特定DNA片段，能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。转座子不仅能在本基因组中转座，也能转入其它植物的基因组中。转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得到相对应于变

动植物样品的采集及DNA样品的提取2015/12/28

7.1.动物样品的采集及处理方法遗传学数据在野生动物和圈养动物的保护和管理中变得日益重要。在本文中，我们总结了一些能简便而有效地获得样品及数据的方法。我们在采集样品之前，对将要进行的遗传学分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，当采集地与实验室有相当距离时，采集者常常要保存好样品直到有合适的接受者或存放地，这就要求采集者应具备一定的经验。首先，所有样品均应以个体序号进行标注，并且应写上种名、性别、采样者姓名以及采集日期，越详尽越好，以便同一个体的不同类数据可以相互引用，另外，地理来源的标注也很

质粒的酶切鉴定及片段回收2015/12/24

一、小量酶解反应主要应用于质粒的酶切鉴定。10ul反应体积中含1mgDNA，酶切反应体系如下：质粒dna1mL10×缓冲液1mL两种限制酶各0.5mL+0.5mL双蒸去离子水7mL总体积10mL[操作方法]按下列顺序加入试剂：(1)在一灭菌的新的Ep管中加入7ul双蒸水。(2)加入10×缓冲液1mL。(3)加限制酶KpnI0.5mL，SacI0.5mL。(4)zui后加入质粒DNAlmL。(5)稍离心，混合。(6)37℃水浴1—1.5h。(7)取出后电泳分析鉴定是否酶解。[注意事项](1)双蒸水

DNA重组技术一：酶切、连接2015/12/21

实验原理:DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5’…G↓AATTC…3’→5’…GAATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’→3’…CTTAAG…5’构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限

五种不同的制备siRNA方法的比较2015/12/16

比较项目化学合成体外转录RNAseIII降解dsRNAsirna表达载体PCR表达框材料需求21-merRNAoligos(一对)29-merDNAoligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7启动子)55-60-merDNAoligos(一对)~50-merDNAoligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天—2周24小时+DNAoligo合成时间1天+转录模版制备时间5天以上+DNAoligo合成时间~6小时+DNAoligo合成时间个人所需操作时间几乎不需要*中等中等多

引物（primers）设计2015/12/14

引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求dna聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但zui多不超过50个核

DNA的限制性内切酶酶切分析2015/12/09

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA

DNA分型技术2015/11/30

自1985年英国遗传学家AlecJeffreys建立DNA指纹技术以来，经过近20年的发展，法医DNA分析先后已建立了DNA指纹技术，pcr扩增片段长度多态性分析技术、线粒体DNA测序和DNA蕊片等主要技术，结合其它一些新的技术方法，如MVR-PCR，PCR-SSO，SSP-PCR、DHLPC、TOMEF等，共同形成了现代法医DNA技术。随着新的DNA遗传标记的不断被发现，各种新的DNA分析、分型技术方法的建立，法医DNA分析技术正朝着快速，准确，灵敏度和自动化程度高的方向飞速发展。1.聚合酶链

限制性内切酶的酶切2015/11/23

【基本原理】限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg2+外，还需ATP等其他辅助因子的激活；切割位点和识别序列间的距离不同；有的内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II和III种类型。II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种dna片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II型酶所识别的序列具有反向对

基因克隆策略与引物设计原则2015/11/19

1功能基因克隆的基本策略①根据已知的脊椎动物某一特定基因的氨基酸序列的保守区域设计简并引物，利用RT-PCR技术获得该基因的核心片断，将该片断分离纯化后与T载体连接，转化大肠杆菌，挑取白色菌落，经PCR反应鉴定得到阳性克隆，送阳性克隆的PCR产物去测序，从而获得目的基因的cDNA核心片断的序列。②利用3’-RACE和5’-RACE技术扩增cDNA的3’末端和5’末端，将cDNA核心片断、3’末端和5’末端进行序列拼接，从而获得全长cDNA序列。③通过基因组PCR获得内含子DNA序列，通过基因组步

DNA 的纯度和分子量的测定2015/11/17

一、目的熟练掌握琼脂糖凝胶电泳法。利用琼脂糖凝胶电泳测DNA分子量和质粒dna分子纯度，并熟悉各种核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中的位置分布和某些特性。二、原理琼脂糖是一种直链多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脱水半乳糖以1，3—β糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基因工程上的凝胶剂。当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0条件下带负电荷，在电场作

士锋生物转基因烟草的PCR检测2015/11/10

一、材料、试剂和仪器1材料基因特异引物，转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA，含目的基因得质粒2试剂PCRKit3仪器PCR仪（PE2400），电泳仪，紫外照相装置二、操作程序1.在灭菌1.5mL管中25μl灭菌ddH2O,，加入100ng-1μg转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA中，沸水浴5-10min。取出立即置于冰上，使基因组DNA变性充分。2．在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为25ul)：10×buffer2.5μl4×dNTPs（每种2.5mM）2.0μlprimerI

目的基因片段的回收2015/11/03

6.1实验原理dna片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求：（1）回收片段应有非常高的纯度如从普通凝胶中分离出来的片段不可带有即使是微量的凝胶――凝胶会抑制大部分的酶活力，对于后续DNA片段用于再酶切分析或连接均是不利的。（2）回收过程必须是严格的无dna酶污染的操作过程衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，当降解作用仅发生在粘性末端时，在凝胶电泳中是无法看

植物RNA的分离介绍2015/10/26

1.总RNA的分离总RNA分离的方法很多，常采用的是异硫氰酸胍和b-巯基乙醇这两种RNase抑制剂来抑制RNase的活性，同时，异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl）共同作用可以破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液。由于RNA在碱性条件下不稳定，因而在整个提取过程中体系始终保持酸性至中性，而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起变性后被离心下来，RNA则仍溶于上清缓冲液中，zui后用异丙醇沉淀出RNA。【试剂与仪器】（1）异硫氰酸胍溶液：4mol/L异硫氰酸胍

PCR技术的原理与方法2015/10/12

PCR定义PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一.pcr反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.dna聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+

PCR在进化与生态学研究中的应用2015/09/23

分子分类学虽然用核酸序列数据进行分类研究的优点早已被承认，但序列比较数据的积累过程都是繁琐的。PCR/？通用引物技术所提供的快速测序法促使分子分类学的范围扩展到更多的类群。由序列中得出的均一数据为各种类群的生物提供了一个共同的系统发育框图。序列数据同样也提供了过去的方法所不能提供的分辨率。线粒体DNA的扩增和直接测序也已用地获得序列来证明在关于人类的mtDNA家系图中非洲人是其基础。在另一项研究中，对灵长类型组织相容性基因的系统发育分析表明HLA-DQα基因座的许多等位基因的起源早于人类的发生。

士锋生物PCR各处应用模式2015/09/21

一、兼并引物（Degenerateprimer）PCR密码子具有兼并性，如表22-4，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷（d

士锋生物PCR的*性与局限性2015/09/18

聚合酶链反应即PCR技术，因为其对基因或特定核酸序列在短时间内的极大的扩增效率，已在感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等的诊断和研究中得到了广泛的应用，并在某些方面几乎是难以替代的。但是，像自然界的任何事物一样，PCR也有其局限性，稍不注意，就很容易造成错误的判断。感染性疾病由病原微生物引起，主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等，在PCR出现以前，这些病原体通常采用培养、免疫学方法测定特异抗原抗体，核酸杂交等进行临床检测，但这些方法对某些病原体要么难以进行（如导致结核

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术2015/09/16

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应（参见Pyrosequecing的原理），在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可zui终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸