DNA 的纯度和分子量的测定

　　一、目的
　　
　　熟练掌握琼脂糖凝胶电泳法。
　　
　　利用琼脂糖凝胶电泳测DNA分子量和质粒dna分子纯度，并熟悉各种核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中的位置分布和某些特性。
　　
　　二、原理
　　
　　琼脂糖是一种直链多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脱水半乳糖以1，3—β糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基因工程上的凝胶剂。
　　
　　当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0条件下带负电荷，在电场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。迁移率与下列因素有关：
　　
　　1.核酸分子的大小：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状双链DNA分子的分子量对数成反比（图3－1）；所以根据迁移率大小可测定DNA分子的大小。
　　
　　不过实际应用时，通常将待测定的DNA和已知分子量大小的标准dna片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可知该样品的分子量大小。
　　
　　2、迁移率与核酸构象有关,琼脂糖凝胶电泳可以鉴别分子量相同但构型不同的DNA分子。在依常规方法抽提的质粒DNA通常具有三种不同的构象:超螺旋型（SC）、线形（L）和开环型（OC）。这三种构型分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋型（SC）迁移速度zui快，其次为线状（L）分子,zui慢的为开环型（OC）分子。若提取到的质粒DNA样品中,还有染色体DNA或RNA,在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度(图3－2)。
　　
　　图3－2凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5×TBE,0.5ug/ml溴化乙锭电泳条件1v/cm16小时）
　　
　　DNA的纯度和分子量的测定
　　
　　图3－3提纯和未提纯质粒DNA电泳图