引物延伸分析实验2016/08/22

引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端，确定转录的起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA,长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到*分离效果。

核酸酶的分类与发展史2016/08/15

分类一、核酸外切酶有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶;也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一种3′→5′外切酶，水解产物为5′核苷酸;核酸外切酶从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一种5′→3′外切酶，水解产物为3′核苷酸。二、核酸内

平端DNA连接的优缺点、要求条件、实验步骤和注意事项2016/08/04

T4噬菌体dna连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana，1972;Sgaramella和Ehrlich，1978)，由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。优点：1、没有连不上的，只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自

植物microRNAs合成过程2016/08/01

microRNAs(miRNAs)constitutealargegroupofendogenoussinglestrandedsmallRNAs(19-24nucleotides)havingnegativeregulatoryfunctionongeneexpression.Theyareprocessedfromlongernon-codingRNAswithcharacteristicfold-backstructuresbydouble-strandspecificRNasesofth

大尺度鉴定miRNA靶点新方法2016/07/27

《自然—方法学》网络版近日介绍了瑞士苏黎世大学分子生命科学研究所迈克尔•恩加特纳(MichaelOHengartner)研究组发明的一种大尺度鉴定miRNA靶点新方法。在过去几年中，随着实验和计算方法的发展和完善，miRNA靶点的鉴定和预测研究取得很大进展。然而，全面正确地鉴定miRNA的生物学相关靶点依然是个难点。恩加特纳研究组发明了一种叫做“选择性反应监测”(selectedreactionmonitoring，SRM)的方法，该方法利用有针对性的质谱技术实现了对miRNA-靶点互作的大尺度

小分子RNA之microRNA综述2016/07/25

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰(RNAinterference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的*科学成就中RNAi名列。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新

大肠杆菌与操纵子学说2016/07/20

1961年，法国科学家莫诺(J·L·Monod，1910-1976)与雅可布(F·Jacob)发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。莫诺与雅可布zui初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶(叫做“半乳糖苷酶”)，能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖

重组体DNA分子的选择与鉴定2016/07/18

“选择”(selection)和“筛选”(screening)的基本含义。选择，是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。选择所涉及的范围较为广泛，包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择(simpleselection)，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接选择(directselection)。筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程。一.遗传检测法(1)根据载体表型特

重组DNA的转化和蓝白筛选2016/07/15

体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和表达，其首要目的是获得大量的克隆基因。虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。重组质粒导入宿主细胞zui常用的方法之一就是转化(transformation)。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它菌属包括大肠杆菌自然状态下无法发生转化，但可以通过人工诱导使其处在易于接受外源DNA分子的状态即

重组质粒的连接、转化及筛选2016/07/12

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的dna片段(外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是zui容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端用相

受体菌感受态细胞的制备方法2016/07/04

目的与原理当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。二、材料和方法1.材料：大肠杆菌2.仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜3.试剂lb培养基，0.1MMgCl2，3mM氯化六氮合高钴TFB：10MmMES(pH6.3)45MmMnCl210MmCaCl210MmKCl三、操作步骤大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时

DNA目的片段的回收方法2016/06/30

一、原理回收目的片段的方法很多，常用的有冻融法，低熔点琼脂糖法，透析代法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。本实验采用电泳回收法。通过特别的V形电泳槽，将挖出的含有目的片段的凝胶置于V形槽前，接通电泳电源，DNA即进入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管较小，回收的DNA片段能保持较高的浓度。二、实验步骤1.大量酶切产物的电泳分离：琼脂糖为0.8%，选用大型电泳槽及厚梳子，并载低电压下电泳以提高分辨率。2.紫外灯下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝胶。3.把凝胶片置于特制的V型槽平台上，在V

RNAi的作用机制及其放大效应2016/06/28

RNAi的作用机制RNAi的作用体现在两种水平上①转录水平。RNA可以介导DNA的甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)zui早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA(double-strandRNA)被降解成21～23个核苷酸长的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核可以诱发同源序列的DNA甲基化。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA-DNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默

microRNAs技术简介2016/06/22

micrornAs(miRNAs)是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。尽管在10年前已经发表了*篇关于miRNA的论文，直到zui近miRNA的普遍性和重要性才逐渐被

DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法2016/06/15

基本原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶(水解磷酸二酯键)。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。主要试剂重组质粒DNA插入片段300bp本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：5′----G↓AATTC----3′3′----CTTAA↑G----5′磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。操作步骤1.反应体系的建立：⑴在一无菌1.5mleppendorf管中加入：无菌双

mRNA的分离纯化2016/06/02

真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cdna文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?gRNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mgRNA。其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3

JM109，DH，BL21感受态有何区别2016/05/30

1：DH菌株DH是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3)菌株该菌株用于表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合

小RNA与蛋白质的相互作用2016/05/25

摘要：小分子调控RNA，包括siRNA(smallinterferingRNA)、miRNA(micrornA)和piRNA(piwiinteractingRNA)、hsRNA(heterochromatinassociatedsmallRNA)等，是当前生命科学研究的前沿热点。越来越多的证据表明，这些小分子RNA存在于几乎所有较高等的真核生物细胞中，对生物体具有非常重要的调控功能。它们通过各种序列特异性的RNA基因沉默作用，包括RNA干扰(RNAi)、翻译抑制、异染色质形成等，调控诸如生长发育

植物DNA的提取与测定2016/05/23

一、目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。二、原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，zui后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DN

DNA测序原理和方法2016/05/16

DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用zui多的一种型号。本实验介绍的是ABIPRISM310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】ABIPRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司