生物信息学精讲之进化树2016/05/11

分子钟的发现对于进化研究具有十分重要的意义。它不仅能用于粗略估计不同类群生物间的进化时间，亦可用于构建进化树。实际上，分子钟发现不久，蛋白质序列分析即被广泛用于生物的长时进化研究。根据蛋白质的序列或结构差异关系可构建分子进化树(evolutionarytree)或种系发生树(phylogenetictree)。进化树给出分支层次或拓扑图形，它是产生新的基因复制或享有共同祖先的生物体的歧异点的一种反映，树枝的长度反映当这些事件发生时就存在的蛋白质与现在的蛋白质之间的进化距离。根据进化树不仅可以研究

组织和细胞总RNA提取（TRIzol法）2016/05/09

TRIzolRNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出提取RNA的产品，其操作方便、快捷。（一）试剂准备1．TRIzol试剂。2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPCH2O配制）5．DEPCH2O（二）操作步骤1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）2016/05/03

甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。*部分基因组DNA的提取。这一步没有悬念，*可以购买供细胞或组织使用的dna提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取*可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶k及RNA酶以去除两者。使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：rna酶必须要

测序常见问题及其分析2016/04/26

1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行page纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2

ISSR分子标记的实验原理及操作流程2016/04/25

ISSR标记ISSR（inter-simplesequencerepeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，导致

PCR常用优化策略2016/04/19

PCR过程中如果没有找到*的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中zui主要的优化变量包括Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度zui为重要。1．降落PCR降落PCR代表了一种*不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不

如何从RNA抽提到电泳鉴定2016/04/14

RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃，然后送至高压3次，

siRNA的设计与制备2016/04/06

一．sirna的设计在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，zui有效的siRNAs是21-23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物细胞，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。选择siRNA靶位点：从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为侯选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的si

各种转染方法比较2016/03/30

转染方法原理主要应用特点厂家及产品DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS细胞系sigma-aldrich(DEAE-DextranTransfectionKit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，

RNAi起源与专有名词2016/03/28

发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。lang=EN-US1995年，康乃尔大学的SuGuo博士和lang=EN-USKemphues在试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义rna技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（senseRNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义

RNAi技术：体外转录合成双链RNA2016/03/21

在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的RNAi现象，实验表明通过目的基因序列的双链RNA可以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的dsRNA，zui简单的方法就是体外转录合成双向的RNA。如果研究对象不是哺乳动物细胞，那要开展RNAi的实验就要简单很多。因为可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象，而无需制备特定的sirna。在这里生物通将介绍几个制备长链dsRNA的试剂盒。（值得注意的是在哺乳动物细胞内，大于29nt的双链RNA引发的是非特异基因沉默，21nt大小的双链RNA，也就是我们前面

RAPD技术及其在假丝酵母菌研究中的应用2016/03/16

近年来，随着肿瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等患者的不断增多，侵入性诊断治疗手段的广泛实施，各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，临床上真菌感染呈明显上升趋势［1］，其中假丝酵母菌在医院真菌感染中zui常见，占80%以上［2］，故快速、准确地对其鉴定、分型并分析该菌种间、种内的亲缘关系对研究假丝酵母菌的致病性、药物敏感性、预防监测流行病学调查具有重要意义。传统的真菌分型方法主要是表型分型如形态学法、血清学法、药物敏感性分型等，但耗时费力，易受环境及人为

PROTOCOL FOR NORTHERN BLOTTING2016/03/07

Developedby:ChristopherToddHittingerModifiedfrom:"Bio-RadVacuumBlotterInstructionManual"ａnd"AnalysisofRNAbyNorthernａndSlotBlottingHybridization"fromShortProtocolsinmolecularBiologyPreparation1.EVERYTHINGmustbeThoroughlycleanedofRNAses,ａnduLovesmustbe

从λ噬菌体DNA的纯2016/02/29

ThisisamodificationoftheprocedureinShortProtocols(1-41,1-45)1.Preparea50mllIQuidlysate:A.mix2xlO8E.coliCellswith100ulphage(fromonepickedplaquein500ulSM),and100ullOmMMgCl2/lOmMCaCI2.Adsorbat37°for15min.B.transferto50mlLBmedium(supposedtobeNZC,we"veuse

基因分离克隆的方法2016/02/22

1基因芯片技术分离目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂

特定基因表达水平的检测2016/01/25

继分析DNA的southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNAzui为常用的经典方法。与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（

双链短RNA[dsRNA]合成方法2016/01/21

WeroutinelyproducedsRNAbyinvitrotranscriptionofaPCRgeneratedDNAtemplatecontainingtheT7promotersequenceonbothends(I.primerDesigneddsRNA).ItisalsopossibletoproducedsRNAusingPCRgeneratedDNAtemplatescontainingeithertheT7&SP6ortheT7&T3promotersoneitherend

SMART技术简介2016/01/19

真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3’末端都带有一段PolyA，这是利用逆转录酶制备cdna文库的基础。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3’末端加上一连串的G或者C（或者A/T），

DNA抽提标准化操作规程2016/01/14

1目的：DNA抽提标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA抽提操作。2适用范围：DNA抽提实验室3依据：DNA抽提标准化操作规范4引用文件：德国BAG公司（以下简称BAG）《InstructionsforuseEXTRA-GENEI》5程序5.1试剂准备5.1.1BAG®EXTRA-genEI该试剂盒包括3部分：Solution1、Solution2、Solution3使用前，若Solution2有沉淀请将其在37℃孵育，直至沉淀*溶解5.1.2乙醇溶液，浓度（V/V）为96%或100％5.1.

Southern印迹杂交2016/01/12

实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中zui常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。Southern