士锋细菌转化实验2015/09/09

．实验目的细菌转化实验1．以pGLO质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。2．验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解。二．实验原理转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程*的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。本实验是用pGLO细菌转化试剂盒中提供的pGLO质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl2转化法。pGLO质粒：细菌转化实验pGLO质粒上主要含有两个

DNA芯片检测siRNA专一性2015/09/06

长片断的双链RNA(dsRNA)导入例如植物，真菌，果蝇，线虫等生物的细胞中会引发同源mRNA的降解——这就是所谓的RNAinterference(RNAi)。RNAi分两个步骤，首先是长片断双链dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25个碱基的smallinterferingRNAs(sirnas)。这些siRNA随后和相关蛋白组合成为RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)，这个复合物以同源mRNA为靶摧毁mRNA。两年前ElbashirａndTuschl用siR

士锋RNAi及其在植物遗传改良中的应用2015/09/01

RNAi即RNA干涉(或RNA干扰)是指双链RNA导入细胞后并被切割成21～23个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致其降解，从而使得内源基因不能表达，导致内源基因的沉默。自1998年Fire等在线虫中发现并阐明以来，RNAi已经在其它动物、植物和真菌中被证实。研究表明参与该过程的许多基因具有高度的保守性，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的古老生理机制。RNAi所具有的特异性、稳定性、、快速以及不改变基因组的

士锋PCR问题的总结2015/08/20

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不*。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，

士锋PCR技术：PCR产物测序2015/08/05

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测序技术相结合后，它将成为一种zui快、zui有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为了区别在PCR反应过程中由dna

士锋RNAi技术初探2015/07/27

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(smallinterferingRNA，sirna)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。RNA干扰现象不

稳定表达具有生物活性的人重组对氧磷酶2015/07/24

INTRODUCTIONSerumparaoxonase-1(PON-1)isahigh-densitylipoprotein(HDL)-associatedcalcium-dependantesterasewithantioxidantａndanti-atherogenicproperties.Theactivityofparaoxonase-1hasbeenimplicatedinthepathogenesisofmanydiseasestates,includingmetabolicsyn

葡萄糖醛酸-转移酶活性的测定2015/07/20

葡萄糖醛酸转移酶是指能催化间接胆红素与葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸酯(即直接胆红素）的酶。

液相色谱之排阻液相色谱2015/07/15

液相色谱（HighRerformanceLiquidChromatography,HPLC）又叫高压、高速、近代液相色谱，通常叫做液相色谱。它是60年代中期才建立的一种快速分离化合物的方法，到了70年代后期才广泛用于蛋白质的分离纯化方面，现已成为分离纯化蛋白质非常有效的方法之一。和经典常压色谱相比它有以下特点：1、HPLC分离、纯化蛋白质的速度快。通常半小时左右可进行一次，大大缩短了纯化蛋白质的时间；2、分辩率高。一根长10cm的色谱柱可分离十几种以上的物质；3、适应面广，灵活性强，几乎所有的蛋

士锋蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验2015/07/07

[原理]蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移

士锋PVDF膜上蛋白的可逆染色2015/06/29

Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。1.氨基黑染色染液：0.5%AmidoBlack(w/v),25%isopropanol(v/v)ａnd10%aceticacid.染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH2O脱色。2.考马氏亮蓝染色染液：0.1%CoomassieBrilliantBlueR-250(w/v)ａnd50%methanol(v/v)脱色液：40%methanol(v/v)with10%aceticacid(v/v)染色

蛋白质组分析中的初步分离2015/06/23

在分析质谱产生的二维图谱上的蛋白质斑点时，看起来似乎只有通常含量比较高的蛋白质(编码偏倚指数大于0.2)才能*被鉴定出来。因而，二维胶上的斑点数量不能代表可以分析的全部表达的基因的数量或种类。Gygi等(2000)曾经计算过，在二维作图的早期阶段，如果只装入40ug酵母溶出产物，那么只有丰度超过至少51000拷贝(每个细胞)的多肽才能被检测到。如果起始的蛋白质总量是0.5mg，那么丰度超过1000拷贝(每个细胞)的蛋白质就可以通过银染看到，但是那些每个细胞含100拷贝和10拷贝的都不能再现出来。

新型人造酶可用于标记蛋白2015/06/15

使用一种不被自然利用的稀有金属，莱斯大学的化学家们发明了一种合成酶，有助于解开难以研究的数千种蛋白质的身份，其中包括许多在癌症和其他疾病发挥关键角色的蛋白质。这项研究zui近在线发表在《美国化学学会杂志》上。“我们已经将铑的化学性能和目前生物学已知能识别和选择的特定蛋白结合在一起，”共同研究作者ZacharyBall，莱斯大学化学助理教授说，“结果是一种工具，在许多方面，比任何单独使用生物或化学的方法更有效。”Ball三年前开始研究双铑催化剂。他一开始没有试图用它们们来合成酶，但他对一个研究产生

水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA2015/06/09

实验原理闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。实验步骤1.选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。2.选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。3.制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。4.用吸管取少量琼

PPO粗酶液的纯化2015/06/03

一、原理1.葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部zui先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而zui后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质）2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到

SDS-PAGE胶染色2015/06/01

一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较染色方法灵敏度与质谱的兼容性Silver1-10ng-Silver(MScompatible)10ng+ComassieG-250orR-25030ng+Antibody(Westernblot)1ng-二、考马斯亮蓝染色CBB染色液：0.5%考马斯亮蓝G250或R250；40%甲醇；10%乙酸；将CBB溶于甲醇中并不停的搅拌15min。加入乙酸与ddH2O脱色液：30%甲醇；10%乙酸染色方法：1.在摇床上染色30min；2.脱色至蛋白点或条带清晰可见；3.dd

双向电泳溶液配制方法2015/05/29

A.裂解液(lysissolution)(8MUrea,4%CHAPS,2%Pharmalyte3-10,40ml)FinalconcentrationAmountUrea(Fw60.06)8M19.2gCHAPS4%(w/v)1.6gPharmalyte3-102%800μlDoubledistilledH2OTo40ml新鲜配制或者分装贮存于-20℃①如果需要，尿素的浓度可以调高到9或者9.8M，也可用7MUrea，2MThoiurea。②其他的去垢剂（如TritonX-100，NP-40，

测定蛋白浓度2015/05/25

一、实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度zui高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色

重组细胞因子分类及应用概述2015/05/21

、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为：由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子(lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺

琼脂糖凝胶电泳检测DNA2015/05/19

目的：学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小。原理：琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度zui快，其次为线状分子，zui慢