考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液常见问题2015/05/13

问题原因对策背景高SDS及盐类等杂质未除尽电泳结束后，取胶放入双蒸水或去离子水中，延长洗涤时间或增加洗涤次数。染色过程中试剂变成蓝色染色后未见蛋白条带SDS及盐类等杂质未除尽电泳结束后，取胶放入双蒸水或去离子水中，延长洗涤时间或增加洗涤次数。凝胶过厚（超过1mm）建议使用厚度小于1mm的凝胶；如果胶非常厚，每次的洗涤时间需加长。蛋白上样量太少建议在电泳时加两个不同量的BSA，并将此两个泳道作为阳性对照。

选择纯化凝胶的具体方法2015/05/07

生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出zui有效的纯化流程。1.测定------分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的SuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的*PH。2.选择------层析方法若对目标蛋白的

考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度2015/04/24

(一)实验原理双缩脲法(Biuret法)和Folin?酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度zui高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的zui大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜

蛋白定量技术2015/04/14

（一）双缩脲测定法1．原理蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。2．试剂配制硫酸铜（CuSO4.5H2O）1.50g酒石酸钾钠5.00gH2O500.0ml10%氢氧化钠（不含硫酸钠）300mlH2O加至1000ml此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。3．标准曲线的制备⑴准确称取牛血清白蛋白1.0g（必要时须首先

表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析2015/03/27

一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。

体内体外表达2015/03/25

作为分子生物学领域老牌厂家，Promega同样有很有特色的原核表达系统，不过纵观Promega近年的表现，似乎不满足于此，而是将目光投向了跨物种间的穿梭表达，以及越来越热的体外表达系统了。蛋白纯化，永远是蛋白表达后zui令人关注的问题。Promega的PinPoint?Xa表达系统则是巧妙利用了生物素作为亲和纯化的中介――将目的基因克隆到表达载体上的一段“神秘”多肽的DNA序列后面，这段‘神秘’多肽表达后在细胞体内会自然被生物素修饰，所以大肠杆菌表达出的融合蛋白就是已经被生物素标记了的融合蛋白―

蛋白质组，蛋白质组学及研究技术路线2015/03/17

因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现

聚丙烯酰胺凝胶层析（PAGE）的技术数据2015/03/12

大分子核酸的检测通常使用琼脂糖凝胶层析，但是由于其分辨率不够，所以检测小分子核酸使用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）层析，分辨率可以达到几个bp。对于PAGE胶的一些技术参数罗列如下表：型号排阻的下限（Mr）分级分离的范围（Mr）膨胀后的床体积（mL/g干凝胶）膨胀所需zui少时间（室温，小时）Bio-gel-P-21600200~20003.82~4Bio-gel-P-43600500~40005.82~4Bio-gel-P-646001000~50008.82~4Bio-gel-P-1010000

转录分析的5种方法2015/03/10

号通路，只有一个目的：将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。不管是胰岛素，还是异亮氨酸，抗原还是肾上腺素，它们的*目的总是如出一则：对转录活性的改变。这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域：如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。经典的凝胶迁移滞后试验（theelectrophoreticmobilityshiftassay）已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特点。即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或

碱性磷酸酶偶氮―偶联 法2015/03/03

人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。1)孵育液配制萘酚AS(或萘酚AS-MX)10―25rugN，N―二甲基甲酰胺液0．5ml0．2mol／LTris盐酸缓冲液(pH8．2―9．2)50ml坚牢蓝B(或BB、RR，或坚牢红TR、坚牢蓝VRT)50mg混合、搅拌及过滤，必要时可使用氢氧化钠调整pH。2)操作程序：①新鲜组织冰冻切片：②人孵育液，37C(或室温下)孵育5―60分钟；③双蒸水洗3～5分钟；④4％甲醛，室温下固定10～15分钟；⑤蒸馏

Feulgen反应原理及Sohiff液的配制2015/01/30

Feulgen反应原理及Sohiff液的配制Feulgen反应是显示DNA的经典而特异的染色方法，由Feulgen(孚尔根)在1924年提出，因而得名。(一)Feulgen反应原理DNA可在酸性条件下水解，嘌呤―脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(―CHO)，再用显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA经稀盐酸处理而水解。除可破坏脱氧核糖与嘌呤碱外，还可水解嘧啶碱。酸水解核酸的程度与水解时间长短有关，随着水解时间的延长，嘌呤碱基增多，形成的醛基也随

原代肝细胞培养、肝非实质细胞、肝脏干细胞2015/01/27

原代肝细胞培养、肝非实质细胞、肝脏干细胞肝实质细胞：指具有执行和完成肝功能单位的细胞。肝非实质细胞：指非具有执行和完成肝功能单位的细胞，这些细胞的功能主要是具有连接和支撑肝实质细胞的作用。如血窦内皮细胞、Kupffer细胞、陷窝细胞（pitcell）及肝脏星状细胞（hepaticslatecell；HSC）。肝脏干细胞：是一种来源于肝脏Herring狭隙和肝内胆管的具有双向分化潜能的细胞，能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞。这种细胞的细胞质少，具有卵圆形细胞核，故又称卵圆细胞。在正常的情况，卵圆

培养细胞的细胞生物学2015/01/19

1.基本概念通常，体外培养的生物成分无外乎两种结构形式：其一是小块组织或称为组织块（tissueblock），一般称为外植块；其二是将生物组织分散后制成的单个细胞，一般称为分离的细胞(isolatedcell)或者分散的细胞(dissociatedcell)。分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中进行，分散的细胞被悬浮于培养液或平衡盐溶液中。单个细胞分散存在于培养液或其它平衡盐溶液中、缓冲溶液中，就称为细胞悬液(cellsuspension)。狭义的细胞培养(cellculture)主要是指分离（

白细胞计数法（试管法）2015/01/08

一、原理用稀乙酸将血液稀释20倍，使红细胞全部溶解，滴入白细胞计数池中，在显微镜下计数，求得每立方毫米血液中的白细胞数。二、器材和试剂1.器材生物显微镜、Neubauer氏血细胞计数池、0.02ml吸管、小试管、刺血针、2ml吸管。2.试剂白细胞稀释液:采用3%乙酸溶液。三、稀释液的配制采用3%乙酸溶液。即取冰乙酸3ml，加蒸馏水至100ml混合。亦可于上述稀释液中加美蓝或龙胆紫液1~2滴，便于观察。稀释液应经常过滤，以除去尘埃、异物或微生物的影响。四、方法1.取血于小试管中加入稀释液0.38m

脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定2015/01/05

一、实验技术及原理运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，zui终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液

Caspase 3 活性测定（FIENA法）检测细胞凋亡2014/12/29

Caspase3的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用，有证据表明，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase3处于核心位置。本法运用荧光酶联免疫吸附法（flurometricimmunosorbentenzymeassay，FIENA）的原理，Caspase3激活后会作用于其特异的底物：乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺（Ac-DEVD），如将Ac-DEVD与荧光素连接（Ac-DEVD-AFC），即会产生荧光裂解产物AFC，而且caspase3的活性与Ac-DEVD-AFC的分解量或

台盼蓝染色法2014/12/22

材料：1.显微镜、玻片、盖玻片、滴管；2.试剂：0.4%台盼蓝染液；3.台盼蓝（Trypanblue）：0.4g；4.生理盐水：100ml；操作步骤：1.用Hanks液配制0.1%台盼蓝溶液；2.用0.5%胰蛋白酶：0.2%EDTA=1：1混合液来消化培养的贴壁细胞；3.再加入适量Hanks液制成细胞悬液；4.将待染色细胞稀释至所需浓度（方法及浓度范围与细胞计数相同）；5.每0.1ml细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴，室温下染3—5min；6.染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后

Hoechst-PI染色法检测细胞凋亡2014/12/15

亚“G1”峰方法简便，但只是代表G0/G1期发生凋亡的细胞，S期和G2期细胞凋亡发生于G1峰后，无法观察。此外，由于全部细胞均经固定，因此不能区别死细胞和活细胞。Hoechst-PI染色则可弥补上述不足。Hoechst33258可被活细胞摄取，与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继而PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧光可分辨三种细胞：正常活细胞对染料有拒染性，蓝色和红色荧光均较少；凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，表现为强蓝色荧光，弱红色荧光；坏死

人和哺乳动物原代细胞的蛋白质抽提步骤2014/12/04

一、培养的贴壁原代细胞的蛋白质抽提基本步骤1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。2、预冷的1×PBS（pH7.4）清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。3、PriCells蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰

羊水细胞染色体标本的制备2014/12/02

一、原理人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期zui短。AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在再培养中潜在的生长期zui长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3-4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析