Caspase 3 活性测定（FIENA法）检测细胞凋亡

Caspase3 的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用，有证据表明，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase 3处于核心位置。本法运用荧光酶联免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理， Caspase3激活后会作用于其特异的底物：乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺（Ac-DEVD），如将Ac-DEVD与荧光素连接（Ac-DEVD-AFC），即会产生荧光裂解产物AFC，而且caspase3的活性与Ac-DEVD-AFC的分解量或自由荧光产生荧光的强弱成正比。本法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究，而且灵敏度高，特异性强（特异性的抗caspase 3单克隆抗体），与其他已知的caspases无交叉反应。

材料与试剂

1. 20x包被缓冲液 ；

2. 20x抗caspase3抗体；

3. 封闭缓冲液；

4. 孵育缓冲液；

5. 100xDTT；

6. 20x底物Ac-DEVD-AFC；

7. AFC；

8. 阳性对照： 凋亡细胞U937细胞裂解液；

9. 微孔板。

操作步骤

1. 样品制备： 以适当方法诱导（如2x106 个细胞）凋亡（1-24小时）。诱导后，以冷PBS洗涤细胞并离心（300xg）5分钟，收集细胞。设置未经诱导的阴性对照；

2. 重悬细胞， 加入细胞裂解液与之作用，冰上1分钟。 待细胞裂解后可以于-20°c储存一周；或直接离心，室温1分钟，取细胞溶解液100μl用于测定；

3. 包板：用抗Caspase 3 抗体包被液包被微孔板，孵育37℃ 1小时或4℃。 用封闭缓冲液于室温条件下作用30min，以封闭非特异性结合。弃去封闭缓冲液，并用孵育缓冲液洗三次；

4. 测定Caspase 3活性：将样本（细胞裂解液100μl、阴性对照、阳性对照）加至抗caspase 3 包被MTP的微孔中，37℃孵育1小时， 弃去未结合标本， 以孵育缓冲液于室温洗板3 次，每次1min。 加入新鲜配制的Caspase底物溶液， 37℃ 反应1~3小时； 然后进行荧光光度检测， 激发波长400nm， 发射波长为505nm。

结果判断

Caspase 3的活性与AC-DEVD-AFC的分解量或自由荧光产生荧光的强弱成正比。

注意事项

此法特异性高，可在106 细胞裂解物中检测出5%的凋亡细胞率。 然而，对特定样本中的检测下限则随凋亡过程的动力学，诱导凋亡的试剂，以及在细胞总数中受影响的细胞数而异。