限制性内切酶的酶切

【基本原理】 
限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg 2+外，还需ATP等其他辅助因子的激活；切割位点和识别序列间的距离不同；有的内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II和III种类型。

II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种dna片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。如 EcoRI和 HindIII的识别和切口分别为： 

EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T 
T TCGA↑ A C TTAA↑G 
限制性内切酶对环状质粒dna产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目；从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。 
质粒DNA的相对分子量（Mr ）一般在106～107 范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为 2.8×106 ，在细胞内有三种构型：①共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA；③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，*开放成线状，简称线性DNA。如果要测定质粒DNA的相对分子量，把质粒用单一切口的酶水解得到线性DNA片段。三种构型的质粒DNA在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA>线状DNA >开环DNA。 
本实验采用限制酶BamHI ，切割pUC18-KanR质粒中插入的分子大小为1200 bp的KanR基因片段。 
【器材】 
1．水浴箱 
2．高压灭菌锅 
【试剂】 
1．10×限制酶缓冲液 
2．限制酶BamH I 
3．DNA样品，重组质粒
【操作步骤】 
1．在Ep管中分别加入以下试剂： 
10×限制酶缓冲液 2μl 
pUC18-KanR 2μl 
ddH2O 15μl 
BamH I 1μl 
2．将上液混匀，37℃保温，1h。 
3．加入1μl 0.5mol/L EDTA（pH8.0）终止反应。 
4．1% 琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。 

pUC18/pUC19 cloning site图