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上海宝叶生物科技有限公司
中级会员·6年
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29
2012年
12月 -
[方法]1，配制两个100ulPCR反应混合液来消化scFV文库，其中1个用于VH-VκscFv文库，另1个用于VH-VλscFv文库，该混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3缓冲液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反应液过夜。要用37℃孵育箱或者有加热盖的加热装置，防止水分蒸发。或者，可以按PCR反应那样加一层矿物油（Sigma）。3．用1%琼脂糖【查看全文】
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27
2012年
12月 -
[方法]1．将电转化仪设置为200D（电阻）、25rtF（电容）和2．5kV。2．在冰上复溶电感受态细菌或使用新鲜制备的电感受态细胞。将电转化杯、杯固定夹、细胞和DNA均放于冰上。3．将80ng已纯化且无盐的DNA与50g1细菌混合。冰上孵育混合物1分钟。4．将混合物转移至0．2cm间距的电转化杯中，小心操作切勿在电极间留气泡。轻拍小杯，使所有液体均沉淀于瓶底。迅速转移以使小杯处于低温状态。5．将透明杯放入电转化仪内，确保小杯侧面干燥（以免电弧）。启动脉冲，立即加入1．0mlSOC培养基并混合。【查看全文】
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27
2012年
12月 -
抗体文库储存料中制备噬菌体。在开始实验之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀释铺板）计算每毫升抗体文库储存料中细菌的数目。在600nm（A600）处的某个特定吸光值下，抗体文库中细菌数目较未感染细菌数目低一些。这或许是因为含有质粒的文库细菌体积更大，或者是存在死细菌。一旦滴度与A600确定关系，吸光值即可用于细菌数目的计算。对于噬菌体的制备（文库救援），来自文库储存料的起始接种量应比文库容量大5倍。接种到培养基后，细菌浓度的A600不应超过0．05。采用文库容量5倍以上的细菌接种【查看全文】
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25
2012年
12月 -
1．在每毫升zui后的噬菌体悬液（例如来自实验方案13．11）中，加入0．45g氯化铯，充分混匀至溶解。2．用吊桶式转头（或与其相当的型号）离心溶液，15℃17h，噬菌体将浓缩在组分1和组分2中（。组分1的浓度较高，但组分2的体积较大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取这些组分。如果是*次使用本实验方案，那么先收集所有条带并分别对其检测将是明智之举。3．将收获的溶液对PBS透析过夜。4．通过感染大肠杆菌DH5cF，或TGl滴定各个不同组分中噬菌体，并保存滴度zui高的组分。通常，噬菌体会集中在1个区带内【查看全文】
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25
2012年
12月 -
从噬菌体抗体文库中分离抗原特异性抗体，是通过让噬菌体进入到在抗原上进行的重复性选择循环来实现的。理想情况下，仅需l轮选择即可完成。但事实是，丝状噬菌体常常非特异性地结合到支持物表面，从而限制了每轮所能获得的富集水平。实际上，需要2～5轮的选择。现在已设计了许多各自不同的选择方法；其中包括在固相支持物上包被抗原进行生物淘选，使用免疫亲和层析注或BIAcore传感芯片，用生物素化抗原选择E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳动物E403细胞、组织培养细胞E41-433、新鲜细胞上进行【查看全文】
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22
2012年
12月 -
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。PBS中10ug／m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液（比如碳酸盐缓冲液）。2．弃去抗原液并用PBS洗涤板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封闭每个板孔，37℃孵育2小时。4．用PBS洗涤板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。7．弃去溶液，用PBS／Tween洗涤板孔3次，再用PBS洗涤3次。8．每孔加入100【查看全文】
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22
2012年
12月 -
噬菌体展示可使抗体亲和力提高到1000倍以上。很典型的起始点是自噬菌体抗体文库中分离特异性抗体。为完成亲和力的成熟（亲和力的增加），要对抗体序列进行多样化；突变基因文库展示在丝状噬菌体表面上，并在抗原上选择具有更高亲和力的结合性抗体。尽管整个过程已相当清晰，但研究者在进行体外亲和力成熟前必须明确：提高特定抗体亲和力将会产生预期的生物学效果。当尝试用抗体中和循环中的毒素或生长因子时，更高的亲和力就显得特别重要。在此情况下，抗体与抗原都分布于同样的区域，能使抗原抗体的相互作用达到平衡状态。亲和力越高【查看全文】
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20
2012年
12月 -
利用含有目标受体的复杂混合物，对噬菌体展示肽文库进行筛选。这适用于许多令人感兴趣的生物体系，如血清、脑脊液及其他生物性体液和细胞或组织表面等。在此情况下，目标就是要鉴定出结合于特定受体分子或结合于一组具有特定性质的受体上的多肽。我们及他人都在致力于鉴定那些可与疾病特异性相关的抗体（疾病特异性抗体，DS-Ab）相结合的多肽。这里我们所描述的方法，是用来鉴定丙型肝炎感染（HCV）特异性相关抗体的相应配体。HCV是一种性慢性肝病的主要病因。利用来自HCV感染者和非感染者的血清（以下分别称为阳性血清和阴【查看全文】
