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上海宝叶生物科技有限公司
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电转化连接物构建抗体文库
2012-12-27 阅读(1378)
[方法]
1．将电转化仪设置为200D（电阻）、25rtF（电容）和2．5kV。
2．在冰上复溶电感受态细菌或使用新鲜制备的电感受态细胞。将电转化杯、杯固定夹、细胞和DNA均放于冰上。
3．将80ng已纯化且无盐的DNA与50g1细菌混合。冰上孵育混合物1分钟。
4．将混合物转移至0．2cm间距的电转化杯中，小心操作切勿在电极间留气泡。轻拍小杯，使所有液体均沉淀于瓶底。迅速转移以使小杯处于低温状态。
5．将透明杯放入电转化仪内，确保小杯侧面干燥（以免电弧）。启动脉冲，立即加入1．0ml SOC培养基并混合。时间恒定值应在4．5～5．5毫秒范围之间。如果时间恒定值小于4．3秒，则重复DNA沉淀。
6．在每次电转化后的细菌中加入lmlSOC培养基，以250r/min振荡培养，37℃1小时。
7．合并所有电转化培养液，系列稀释后在100mm TYE/amp/glu平板上铺板确定文库容量。
8．以200g、4℃10分钟离心剩余的细菌培养液。将每4次电转化的沉淀重悬于500u1的体积。以每份125ul等量体积分别铺于150mmTYE/amp/glu平板上或将500ul铺于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm2。将这些平板在30℃下培养过夜。
9．加入10m1含15%甘油（0．2gm滤膜过滤除菌）的TYE/amp/glu培养基；刮取平板上的细菌。在-70℃下储存抗体文库。
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