一韦仪器加强型冷冻组织研磨仪HGC48用于酿酒酵母总RNA提取的前处理方案

方案概述

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为真核模式生物，其基因表达调控研究依赖于高质量总RNA的获取。酵母细胞壁厚实坚韧，富含β-葡聚糖和甘露聚糖，传统酶解破壁法（如蜗牛酶处理）需耗时1～2小时，且酶活性批次间差异大，易导致RNA降解。一韦仪器HGC48加强型冷冻组织研磨仪采用垂直珠式研磨技术，通过0.5mm氧化锆研磨珠的高频冲击，可在20秒内快速粉碎酵母细胞壁，释放全部RNA。液氮速冻和-30℃低温研磨过程可瞬时抑制内源性RNase活性，最大限度保证RNA完整性和丰度，适用于酵母转录组测序、qRT-PCR基因表达验证及非编码RNA研究等领域。

实验仪器和材料

·       仪器：一韦仪器加强型冷冻组织研磨仪HGC48（配2ml研磨管48孔适配器）

·       材料：酿酒酵母（S288C）YPD培养基过夜培养菌液、0.5mm氧化锆研磨珠、TRIzol总RNA提取试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC水配制）、DEPC处理水、液氮、RNase-free离心管和枪头

实验步骤

1.       酿酒酵母在YPD液体培养基中30℃过夜振荡培养至对数生长中期（OD₆₀₀≈0.8～1.0），取2ml菌液于4℃下8000rpm离心5分钟收集菌体。

2.       用1ml DEPC处理过的PBS洗涤菌体2次，离心后彻底弃去上清，收集菌体沉淀。

3.       将菌体沉淀转移至预冷的RNase-free 2ml研磨管中，加入0.5g 0.5mm氧化锆研磨珠和1ml TRIzol试剂（注意研磨管和研磨珠均需提前DEPC处理并预冷）。

4.       研磨管浸入液氮速冻1分钟，取出后迅速固定于一韦仪器HGC48适配器中，对称配平。

5.       设定一韦仪器HGC48研磨参数：频率70Hz，时间20秒，冷冻模式温度-30℃。

6.       启动研磨程序，完成后室温静置5分钟使核蛋白复合物充分解离，然后加入200μl氯仿，剧烈手动振荡15秒，室温静置3分钟。

7.       4℃下12000rpm离心15分钟，小心吸取上层水相至新RNase-free管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃沉淀1小时。

8.       离心弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥后加入30～50μl DEPC水溶解RNA。

9.       取1μl RNA用于Nanodrop测定浓度及纯度，取2μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检查完整性，另取1μl用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RIN值。

实验数据

结论

一韦仪器加强型冷冻组织研磨仪HGC48配合0.5mm氧化锆研磨珠，可在20秒内超快速破碎酵母细胞壁，总RNA提取时间较传统酶解法缩短90%以上。液氮速冻和低温研磨全程保护RNA免受RNase降解，所得RNA纯度好、完整性高（RIN≥8.5），完全满足RNA-seq文库构建、qRT-PCR和Northern blot等高要求下游实验，为酵母分子生物学和合成生物学研究提供了高效、稳定的样品前处理工具。

• 加强型冷冻组织研磨仪

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