士锋生物ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析2014/01/07

一.elisa标准操作要点的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。1.标本的采取和保存大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会

吞噬细胞吞噬功能检测2014/01/06

一、基本原理吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠，可刺激巨噬细胞的聚集。四日后小鼠腹腔内注入羊红细胞悬液，一小时后解剖收集腹腔吞嗜细胞，染色、镜检可观察对羊红细胞的吞嗜现象。通过计算吞嗜百分比或吞噬指数可测定吞噬细胞的吞嗜功能。二、材料1.ICR品系小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）2.pbs缓冲液3.3％硫代乙醇酸钠4.羊红细胞（1％悬液，北京大学医学部实验动物中心提供）5.解剖器材、注射器、尖吸管、橡

士锋生物免疫酶测定法（ELISA）介绍2014/01/02

（一）elisa实验原理及类型将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤的不同，通常有三种类型的检测方法。1．间接法此法是检测抗体zui常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图1

士锋生物单克隆抗体技术原理2013/12/30

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或

士锋生物动物的选择与免疫2013/12/27

（一）动物的选择目前应用zui广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用zui广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。（二）免疫一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有

血清IgG的分离制备—盐析法2013/12/24

（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Saltingin）。而当盐浓度继续增加到

士锋生物单克隆抗体的制备2013/12/20

（一）杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1

免疫胶体金技术实验原理2013/12/18

（一）原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗

士锋生物抗体的制备原理与方法2013/12/18

抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体

免疫组织化学:几种溶液的配制方法2013/12/16

1、PBS:取ZLI-9061PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。2、TBS：2.1Tris缓冲液配方：（0.5MpH7.6）Tris（三羟甲基氨基甲烷）60.57g1NHCL约420ml双蒸水加至1000mlTris缓冲液配制方法：先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6，zui后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。2

士锋生物Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞2013/12/13

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑（1）细胞纯度；（2）细胞获得量；（3）细胞活力；（4）使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。（一）原理:常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌

士锋生物细胞培养常见问题解析2013/12/11

1、如何选用培养基?培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的是AIMV培养基（SFM）2、为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。3、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L

细胞转染实验之如何做好脂质体介导DNA转染2013/12/09

脂质体介导是目前条件下zui方便的转染方法之一，适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，其转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：*，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者*的剂量，确定出转染时间（2～24小时）。因LR

士锋生物常用的标记免疫酶及其底物2013/12/05

.标记酶的选择条件⑴活性高，分解底物的能力强。⑵特异性强，即作用于底物的专一性强。⑶与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。⑷与底物作用可以显色。⑸纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。⑹可溶性（水溶性）好，在溶液中稳定。⑺测定方法简单。⑻酶来源方便、价格低廉。2.符合条件的酶⑴辣根过氧化物酶（HorseradishperoxidaseHRP），分子量40000。⑵碱性磷酸酶（AlkalinephosphataseAKP），分子量82000。⑶β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540000

士锋生物免疫血清的鉴定、纯化和保存2013/12/03

一、免疫球蛋白的提取与鉴定：各类免疫球蛋白及其与其它血清蛋白间，根据它们的分子大小、电离密度、等电点以及在水溶液中的溶解度不同等，得以相互鉴别与分类。利用上述特性，还可以从液体中分离和提取各种免疫球蛋白。（一）免疫球蛋白的分离提取：1．盐析法（Saltfractionation）：蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同。血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。其方法步骤如下：（1）配制饱和硫酸铵溶液：取500ml蒸馏水加热至70~80℃，将400g硫酸铵溶

士锋生物免疫印迹法2013/12/02

次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗

士锋生物免疫组织化学技术2013/11/29

（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（*抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部

士锋生物ELISA（酶联免疫吸附试验）实验分析2013/11/28

Reagents:PBS（pH7.3）CoatingSolution:0.1MSodiumCarbonate（pH9.6）with0.02%SodiumAzideWashSolution:0.9%NaCl-0.05%Tween20（NaCl/T）PBS-TA:PBS-Tween20（0.05%）-sodiumazide（0.02%）pH7.3APSubstrateBuffer:0.05Msodiumcarbonate-0.001MMgCl2（pH9.3）HRPSubstrate:Mixequal

士锋生物免疫学实验室实验须知2013/11/26

一．实验课的目的要求免疫学实验课的目的是加强和巩固对课堂讲授的基本理论的理解和体会，学习和掌握免疫学实验的基本操作技术。为今后的实际工作和科研工作打下基础。为上好免疫学实验课，要求同学做到如下各点：1.课前务必做好充分预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项，做到心中有数。2.在实验进程中，严格按照实验指导所列步骤和要求进行操作，坚持实验的严肃性、严格性、严密性。3.真实记录实验结果，对错误的结果要认真分析，找出原因，得出结论。实验完成后，写出实验报告及时交给老师批改。4.严格遵守实验室

士锋生物吞噬细胞吞噬功能检测2013/11/21

一、基本原理吞噬细胞具有对异物（细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等）吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠，可刺激巨噬细胞的聚集。四日后小鼠腹腔内注入羊红细胞悬液，一小时后解剖收集腹腔吞嗜细胞，染色、镜检可观察对羊红细胞的吞嗜现象。通过计算吞嗜百分比或吞噬指数可测定吞噬细胞的吞嗜功能。二、材料1.ICR品系小鼠2.pbs缓冲液3.3％硫代乙醇酸钠4.羊红细胞（1％悬液，北京大学医学部实验动物中心提供）5.解剖器材、注射器、尖吸管、橡皮吸头、小试管及载玻片、6.瑞氏染