荧光定量PCR检测服务-SYBR染料法

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用；实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，Z后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时辰研究中处于零时的样本。

相对定量应用（Relative Quantification，RQ）

非特异性荧光标记：

1、SYBR Green

   SYBR Green特性：

（1）只有和双链DNA结合后才发荧光。

（2）变性时，DNA双链分开，无荧光。

（3）在延伸结束阶段采集荧光信号。

（4）SYBR Green也能和非特异性的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。

相对定量通过内标定量：
内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。

 

相对定量分析方法：

2-ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、计算表达水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表达量的比值

服务流程：

步骤	客 户 提 供	服 务 内 容	基 屹 提 供
1	新鲜的且尽量多的材料；已知的全长基因序列；尽可能详细的背景资料：DNA/ RNA来源、丰度等。	DNA/RNA提取，根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
2	纯化好的DNA/RNA（大于5 ug/样品）；已知的全长基因序列；尽可能详细的背景资料：DNA/ RNA来源、丰度等。	根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
3		以DNA为模板，对目的基因进行荧光定量PCR检测分析	提供完整的定量分析结果、实验荧光定量扩增曲线及详细的实验步骤。

注意：客户可根据所能提供的起始材料不同，选择从步骤1或2启动项目。