荧光定量PCR检测技术服务-Taqman探针法

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用;实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，Z后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

相对定量应用（Relative Quantification，RQ）    

 特异性荧光标记：

 TaqMan法

 TaqMan探针的特性：

（1）5′端标记有报告基团（Reporter, R），如FAM、VIC等

（2）3′端标记有荧光淬灭基团 （Quencher, Q）

（3）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光

（4）Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

相对定量通过内标定量：
内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。

相对定量分析方法  ：

 2-ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、计算表达水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表达量的比值

服务流程：

步骤	客 户 提 供	服 务 内 容	基 屹 提 供
1	新鲜的且尽量多的材料；已知的全长基因序列；尽可能详细的背景资料：DNA/ RNA来源、丰度等。	DNA/RNA提取，根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
2	纯化好的DNA/RNA（大于5 ug/样品）；已知的全长基因序列；尽可能详细的背景资料：DNA/ RNA来源、丰度等。	根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
3		以DNA为模板，对目的基因进行荧光定量PCR检测分析	提供完整的定量分析结果、实验荧光定量扩增曲线及详细的实验步骤。

注意：客户可根据所能提供的起始材料不同，选择从步骤1或2启动项目。