上海基屹为您解析RNAi抗干扰检测

一．RNAi的发现
 
     早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默（posttranscriptional gene silencing ,PTGS） . 1996 年在脉孢菌属（Neurospora） 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用（quelling） . 发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够*阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其*代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA 干扰。
 
     过去认为, 哺乳动物细胞中不存在RNAi 现象,因为较长的dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导IFN（干扰素） 生成,并激活STAT 途径参与的PKR（dsRNA 依赖性激酶） 的转录,同时dsRNA 本身与PKR 结合也能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子eIF2a 使之失活,导致非特异性的蛋白质合成障碍;另一方面,dsRNA 又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成   2′,5′腺苷酸,激活非特异性的RNA 酶L ,发生非特异性的RNA 降解效应。现在发现, 只要dsRNA 短于30bp ,就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNA ,引起基因沉默,说明dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用,为以后的基因治疗等RNAi 应用领域提供了新的研究方向。 
 
二．RNAi的作用机制
 
     近年来研究发现,干扰性小RNA（ small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA） 是RNA 干扰作用（RNAi） 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸（ nt ） 的特殊双链RNA（dsRNA） 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基RNAi 的主要过程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干扰性小RNA （ siRNA） ,由siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA的形成是RNAi 的*步. 细胞中dsRNA 可通过多种途径形成,如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物;同时转录反义和正义RNA ;病毒RNA 复制中间体;以及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶（RdRp） 催化合成dsRNA等. 在线虫（ C. elegans） 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA。
 
     现已初步阐明RNAi 的作用机制. RNAi 的*步是,dsRNA 在内切核酸酶（一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶） 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶（helicase） 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA 诱导的沉默复合体（ RNA induced silencing complex , RISC） , 由RISC 介导切割靶mRNA 分子中与siRNA 反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用. RISC 由多种蛋白成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性等. 线虫C. elegans中的MUT7（一种RNase D样蛋白） 可能是一种3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源。
 
     的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体;随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体（RISC） ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与。
 
     此外,ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子。
 
     siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶（RdRp） 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应（random degradative PCR） . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能*关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征。
 
     miRNA 与siRNA 的区别：
 miRNA是单链的，而siRNA则是双链的；
miRNA参与正常情况下生长发育基因调控，而siRNA不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA,作为miRNA的完善和补充；
 miRNA在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而siRNA为转录后水平调节基因表达调控；
Dicer酶对两类RNA的加工过程，miRNA为不对称性，仅来自含茎－环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而siRNA加工过程中。