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上海宝叶生物科技有限公司
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用scFv接头PCR装配VH和VL进行scFv基因文库的构建
2012-12-29 阅读(1618)
[方法]
1．在0．5ml微量离心管内配制以下PCR反应混合液。配制成2个“反应管”，1个含有 V。文库DNA，另1个则含有Vl文库DNA。
反应管 对照1 对照2
● scFV接头DNA（100ng/ul） 1．0ul 1．0ul
● VH文库DNA（100ng/ul） 3．5ul 1．0ul
● V-文库DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul） 3．0ul 1．0ul
● 水 6．5ul 5．5ul
2．在每管中加入：
● 水，33ul
● 10×Vent缓冲液，5．0ul
● 20×dNTP， 2．5ul
3．在热循环仪格内加热反应管到94℃，5分钟。如果没有加热盖，则滴加1滴轻质矿物油覆盖反应液（Sigma）。
4．加入2．Ogl Vent DNA聚合酶。
5．以94℃1分钟、65℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环7次，随机地连接片段。
6．7次循环后，保持94℃；每套旁侧引物各加入lul（等物质的量的6种VHBACK引物的混合物、等物质的量的5种JκFOR或JλFOR引物的混合物，使每种引物混合液zui终总浓度达到10pmol/ul）。
7．以94℃ 1分钟、60℃ 1分钟、72℃ 1分钟，共25个循环扩增片段。
8．取3ul PCR反应物， 以确定剪接是否成功。已装配好的scFv长度应为0．8～0．9kb，而且在阴性对照反应中没有相同大小的产物。
9．用1．0％琼脂糖凝胶电泳纯化已装配好的基因文库，再用Geneclean提取。将每种产物重悬于20ul水中。在1％琼脂糖凝胶中，与已知大小和浓度的标准对照品比较，测定DNA浓度。为构建抗体文库，已剪接的scFv基因文库接着必须进行再扩增，添加上限制性位点以便能克隆到噬菌粒载体中。
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