植物内生菌宏基因组研究
- 公司名称 深圳市易基因科技有限公司
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- 更新时间 2025/4/17 16:53:57
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植物内生菌中可培养的微生物种类十分有限,宏基因组学(metagenomics)是研究植物内生菌的有效手段之一。植物内生菌宏基因组研究通过不依赖于纯培养的宏基因组学(metagenomics)研究方法,构建植物内生菌的宏基因组文库,并从该文库中直接筛选获得生物合成基因簇,进一步鉴定其功能, 对植物内生菌进行定性及定量分析，为植物的微生物起源提供直接的证据。
技术优势：
Ø 超深度检测：提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，避免了目的片段的PCR过程，降低bias，随机测序，获取更丰富的序列信息。
Ø 植物组织表面菌处理：通过实验方法去除植物外表面菌株污染，准确测序植物内生菌种类、丰富及互作关系，真实还原构建微生态系统的功能网络。
Ø 16S全长检测：植物内生菌提取DNA后，通过16S全长扩增，质控内生菌提取效果。
研究方向：
植物内生菌宏基因组学研究为植物微生物起源、植物的营养和抗病育种提供内生菌角度的新策略。
技术路线：
DNA样品→文库构建→上机测序→数据分析
实验策略：
外源菌去除→内生菌DNA提取→16S全长质控→建库质控→上机测序
分析内容：
植物内生菌宏基因组测序分析内容 | |
标准分析 | 测序数据质控和统计 1、测序数据质量评估 2、原始测序数据格式介绍（Rawdata） 3、原始数据质量评估（MultiQC） 4、原始数据过滤和数据产出统计 |
去除宿主序列 | |
单样本组装 | |
ORFs 预测 1、生成 gene catalogue 以及其丰度表计算 2、基因集 Pan-Core 饱和曲线分析 | |
群落结构分析 1、 物种注释 1) 物种丰度表 2) 整体物种组成 3) 物种分布统计 2、多样性分析 1) Alpha 多样性分析 2) Beta 多样性分析 3、物种组成差异分析 1) 基于物种丰度的降维分析 2) 物种丰度聚类分析 3) 物种丰度的 Venn 图和花瓣图分析 4) 组间差异物种的 Metastat 分析 5) LEfSe 分析解析差异 biomarker 6) 组间差异 STAMP 分析 7) 物种驱动网络分析 8) 组内核心物种分析 | |
群落功能分析 1、基因功能注释 1) Microorganism 数据库注释 2) COG/NOG 数据库注释 3) KEGG 数据库注释 4) CAZy 数据库注释 5) SignalP 数据库注释 6) TMHMM 数据库注释 7) 耐药基因数据库 CARD 注释 8) 重金属抗性基因数据库 BacMet 注释 9) 氮循环数据库 NCycDB 注释 10) 可移动遗传原件 MGEs 注释 11) 16SrRNA 注释 12) 细菌毒力因子 VFDB 注释 13) 原生生物数据库注释 14) 构建 gene catalogue 注释百科全书
2、功能多样性分析 1) Alpha 多样性分析 2) Beta 多样性分析 3) 功能差异分析 4) KEGG 功能差异 5) COG 功能差异 6) CAZy 功能差异 7) CARD 数据库注释差异分析 8) BacMet 数据库注释差异分析 9) NCycDB 数据库注释差异分析 10) MGEs 数据库注释差异分析 11) Protists 数据库注释差异分析 | |
多组学关联分析 1、环境数据差异性检验 2、相关性关联分析 | |
分箱分析(Bining) 1、Contigs 分箱 2、目标 Bins 分析 | |
注：个性化分析、多组学关联分析请联系对接销售或技术支持 | |
送样要求：
植物内生菌送样要求 | 项目周期 |
Ø 植物内生菌样本 1) 根据植株大小及研究目的确定取样范围，采集植物组织后置于无菌取样袋或50mL离心管中暂时保存，建议每个样采集25g以上，保证分装后每份约10~15g鲜重； 2) 6小时内可用冰袋运输至实验室，超过6小时建议液氮或干冰运回实验室，常温需在2小时内完成采集和运输； Ø 测序策略：PE150 Ø 其他注意事项： ① 最终样本质量以我司的检测结果为准； ② 若样本总量超过要求，可以进行样本保存，反样；项目完成后，将不再保存剩余样品。 | 20个样本以下标准流程的运转周期约为36个工作日。遇到样本数目较多时，项目周期需要与技术支持人员确定。 |
经典案例
病原菌介导植物内生菌群抑病功能的激活
Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.
1、背景
植物微生物组研究已经积累了大量的测序数据和丰富的信息，表明了许多植物根际、叶际、种子和胚层中不同微生物群落的多样性和丰富度。然而迄今为止，很少有研究论证微生物组对特定植物表型（即植物生长、发育和健康）的功能影响。因此，在分子和化学层面上许多植物表型与微生物组结构和功能之间在的因果关系仍然未知。本研究旨在探讨植物内生微生物菌群（植物内生菌）的基因多样性及对真菌感染植株的保护作用。
2、方法
为了解生活在植物根组织中的植物内生菌的抑病功能，作者对生长在抑病土壤中的甜菜幼苗根内进行宏基因组测序分析；并鉴定与抑病相关的微生物群落和功能组成，以区分哪些生物合成基因簇（BGCs）在感染过程中上调，然后重组内生菌群；最后进行位点定向突变，检测特异性BGCs是否在抑病过程中起着重要作用。
作者设置甜菜种植在感病(Conducive, C)和抑病 (Suppressive, S) 土壤和是否接种病原菌R. solani（R）共计四个处理（C,C+R,S,S+R）。在抑病土壤中接种病原菌(S+R)的甜菜发病率为15-30%，在感病土壤中接种病原菌(C+R)的甜菜发病率为80%。
研究实验设计示意图
植物内生菌宏基因组测序分析流程
3、结论
本研究中，植物内生菌的宏基因组学研究和网络推论表明，植物根部的真菌感染在根内Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae富集；同时，几丁质酶基因、编码非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）和聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）产生的各种未知生物合成基因簇。在菌株基因组重建后，由Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae合成的菌群持续抑制真菌根部疾病。定点诱变表明，黄杆菌中此前未鉴定的NRPS-PKS基因簇对内生菌群抑病至关重要。研究结果表明，内生根微生物组（植物内生菌）具有许多尚不为人所知的功能性状，可以共同保护植物内外。
图：内生菌群落生物合成基因簇的多样性和分布
参考文献：
① Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.
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