简化基因组甲基化测序（RRBS/ dRRBS）

大家好，这里是专注表观组学十余年的易基因。

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

1、起始量：100ng gDNA；

2、单碱基分辨率；

3、多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；

4、针对性强，成本较低；

5、基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

• 列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选

• 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究

• 模式动物发育和疾病甲基化研究

背 景：

早产后，未成熟的肠道功能和免疫功能必须迅速适应细菌定植和肠内喂养。但未成熟肠道的较佳饮食策略（如时间、饮食量和饮食类型）和最合适的细菌定植仍然未知。需要更好地理解未成熟肠道如何与环境因素（如营养和微生物）相互作用，以确定如何能确保早产儿对产后生活适应的早期喂养策略。

方 法：

作者为验证肠道表观遗传变化与早产及第1次喂养时的肠道反应有关，以仔猪为模型，对早产猪和足月猪进行全肠外营养（TPN）或部分肠内喂养5天，然后用牛奶进行纯肠内喂养，直到第26天（断奶年龄）。在第0天、第5天和第26天从总共10组猪中收集肠组织，比较分析早产猪和足月猪的肠道结构、功能、微生物组、DNA甲基化和基因表达（每组n=8）。

结 论：

RRBS结果显示，出生时早产猪肠道出现绒毛缩短和整体高甲基化，影响与Wnt信号通路相关基因。在生命的前5天，高甲基化相关的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表达明显降低，但大多数早期甲基化差异在第26天消失。直到第26天，早产猪的蔗糖酶和麦芽糖酶活性仍然降低，肠道微生物群发生改变。0-5天期间显示许多新的甲基化差异，主要表现在未提供肠内喂养（TPN喂养）的情况下。这些甲基化差异影响了与细胞代谢相关的肠道基因，包括通过启动子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表达。总之，未成熟肠道在早产后可迅速适应其基因甲基化和表达的能力，只有少数早产相关缺陷会持续到断奶。结果表明早期肠内喂养对于刺激肠道基因甲基化重编程可能很重要，从而使肠道快速适应早产环境。

背 景：

孵化过程中的温度和CO2浓度对肉鸡的发育有着深远的影响。此前许多研究发现这些参数的差异对孵化心重 (heart weight，HW) 有显著影响。早期生活环境也被证明会影响肉鸡后期的生产性能，因此表观遗传机制可能介导环境刺激引起的长期生理变化。

方 法：

利用RRBS技术评估84只在两种不同蛋壳温度（EST；37.8℃和38.9℃）和三种CO2浓度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉鸡幼体心脏组织的DNA甲基化模式，并进行差异甲基化分析。

结 论：

本研究利用RRBS技术验证了ABLIM2、PITX2和THRSP三个基因的甲基化和表达的协调变化，确定孵化后小鸡心脏的差异甲基化模式与孵化EST和CO2的差异有关，并且这种差异可能通过转录因子结合和基因表达的变化影响心脏的生长和发育。此外，本研究还鉴定了负责调节体温的其他器官（包括下丘脑和甲状腺）的表观遗传模式可能有助于表征调节心脏发育的温度驱动差异机制。总之，对早期生活环境影响的表观遗传特征了解可以作为未来动物表现预测因子，从而有利于动物育种。

参考文献：

① Gao F,et al.Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.

② Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.