细胞JC-1染色实验

一、实验原理

JC-1染料会根据线粒体膜电位变化呈现不同荧光特性：

• ‌正常线粒体‌：膜电位高时，JC-1形成J-聚集体，发射红色荧光(Ex/Em=585/590nm)

• ‌受损线粒体‌：膜电位降低时，JC-1以单体形式存在，发射绿色荧光(Ex/Em=514/529nm)

• 红/绿荧光强度比可定量反映膜电位变化

二、实验材料准备

1. 主要试剂

• JC-1染料(常用浓度1-5mg/DMSO储存液)

• 无血清培养基或JC-1染色缓冲液

• CCCP(50mM)作为阳性对照

• PBS缓冲液

2. 仪器设备

• 荧光显微镜/共聚焦显微镜

• 流式细胞仪(可选)

• CO₂培养箱

三、实验步骤

1. 工作液配制

• 将JC-1储存液用DMSO稀释至2.5-10μg/ml工作浓度

• 或用染色缓冲液稀释(如50μL JC-1+8mL PBS+2mL 5×缓冲液)

2. 细胞处理

‌贴壁细胞‌：

1. 培养至80-90%汇合度

2. 弃培养基，PBS洗涤2-3次

3. 加入JC-1工作液(六孔板1ml/孔)

4. 37℃孵育15-30分钟

‌悬浮细胞‌：

1. 离心收集细胞(300g,5min)

2. 重悬于培养基(10⁶ cells/ml)

3. 加入JC-1工作液(0.5ml/50-100万细胞)

3. 洗涤与检测

1. 孵育后用预冷PBS或染色缓冲液洗涤2-3次

2. 贴壁细胞可消化后收集

3. 荧光显微镜观察或流式检测

四、结果分析

1. 荧光观察

• ‌健康细胞‌：线粒体呈红色荧光聚集

• ‌凋亡细胞‌：绿色荧光扩散至胞质

• 典型结果示例：CCCP处理的阳性对照几乎全部细胞显示绿色荧光

2. 数据分析

• 流式细胞仪检测红/绿荧光强度比

• 计算膜电位变化率：红绿比降低代表去极化

五、注意事项

1. ‌染料处理‌：

• 避免反复冻融，建议分装保存

• 低温会凝固，需20-25℃水浴溶解

• 稀释后立即使用，防止聚集

2. ‌实验控制‌：

• 设置未染色对照和CCCP阳性对照(通常50μM,5min)

• 不同细胞类型需优化CCCP浓度和作用时间

3. ‌图像获取‌：

• 共聚焦显微镜建议488nm激发，530nm(绿)/590nm(红)双通道采集

• 避免长时间光照导致荧光淬灭