BC5510-50T/48S 线粒体乙醛脱氢酶活性检测试剂盒 脂肪酸
- 公司名称 北京索莱宝科技有限公司
- 品牌 SOLARBIO/索莱宝
- 型号 BC5510-50T/48S
- 产地 北京
- 厂商性质 生产厂家
- 更新时间 2024/4/19 17:15:07
- 访问次数 618
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| CAS | 详询 | 纯度 | 详询 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 详询 | 分子式 | 详询 |
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 50T/48S |
| 货号 | BC5510 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
| 主要用途 | 线粒体乙醛脱氢酶（ALDH2）活性检测 |
线粒体乙醛脱氢酶（ALDH2）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC5510
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 2-8℃保存 | |
试剂四 | 液体1.8 mL×1支 | |
试剂五 | 液体7 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前取一瓶试剂二加入3mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；
2、 试剂五：沸点低，在使用时保持低温以保证正确的吸取量。用后及时封口。
3、 工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=550µL：100µL：20µL：30µL：100µL（800µL，1T）的比例配制工作液，现用现配。
产品说明：
线粒体乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）属于乙醛脱氢酶蛋白家族，存在于很多组织，特别是肝脏组织内含量较高。该酶主要参与乙醇代谢过程的第二步，在线粒体内将乙醛氧化成羧酸，然后进入三羧酸循环，被分解，解除乙醛对生物体的毒害作用。另外，ALDH2也可作为酯酶参与硝*油的代谢途径，是硝*油重要的生物活性剂。
ALDH2催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到ALDH2的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液，在冰上用匀浆器或研钵进行快速匀浆（匀浆器可上下研磨30次左右）。
2. 4℃ 600 g离心10min（如需获得纯度更高的线粒体，可将此步离心速度改为1000g）。
3. 将上清液移至另一离心管中，4℃ 11000 g离心15min，弃上清，留沉淀。
4. 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率200W，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于ALDH2活性测定，若用蛋白浓度计算，取20μL用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液37℃预热20min。
3、 操作表：
试剂名称（µL） | 空白管 | 测定管 |
样本 | - | 200 |
蒸馏水 | 200 | - |
工作液 | 800 | 800 |
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定1min时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培养箱反应30min，拿出迅速擦干测定31min时的吸光值A2，计算ΔA测定=A2测定-A1测定，ΔA空白=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA测定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。 | ||
三、ALDH2酶活计算
1. 按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F
2. 按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH2活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F
3. 按细胞数量计算
酶活定义：每106个细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH2活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样÷V样总×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10-3L；V样：反应体系中加入样本上清体积，0.2mL；V样总：线粒体沉淀中加入提取液体积，0.4mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样本质量，g；N：细胞总数，以106计；T：反应时间，30min；109：单位换算系数，1mol=109nmol；F：稀释倍数。
注意事项：
1、 试剂四有毒性，实验过程中，请佩戴好防护用具。
2、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。
3、 样本ΔA大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（60min或更长）来测定。计算时注意同步更改计算公式。
实验实例
1、 取0.1067g小鼠肝脏进行样本处理，用提取液稀释4倍后，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=1.271-0.282=0.989，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.989-0=0.989，按样本质量计算酶活得：
ALDH2活性（U/g质量）=10.718×0.989÷0.1067×4=397.380 U/g质量。
2、 取0.1069g冬枣果肉进行处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=0.267-0.162=0.105，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.105-0=0.105，按样本质量计算酶活得：
ALDH2活性（U/g质量）=10.718×0.105÷0.1069=10.528 U/g质量。
3、 取8×106个细胞进行样本处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=0.249-0.154=0.095，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.095-0=0.095，按细胞数量计算酶活得：
ALDH2活性（U/106 cell）=10.718×0.095÷8=0.127 U/106 cell。
参考文献：
[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078
[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515
[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190
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