BC3290 结合态淀粉合成酶(GBSS)活性检测试剂盒

结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC3290
规格：25T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取试剂二A加入8 mL试剂一，缓慢加热，逐渐升温使其溶解，冷却后加入试剂二B和试剂二C混合溶解，这样可以分两批配制并且测定，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

2. 试剂三：临用前试剂三B加入试剂三A溶解备用，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3. 试剂四：临用前先离心，取7 μL试剂四加入2.24 mL溶解好的试剂三混合备用（约14T），现用现配，也可根据样本量按比例配制。

4. 试剂五：临用前取试剂五B和试剂五C加入试剂五A中溶解备用，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

5. 试剂六：临用前取1支加入208 μL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

6. 试剂七：临用前加入2mL蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存8周，避免反复冻融。

产品说明：
GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。
GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙 酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP⁺还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 在EP管中按顺序加入下列试剂

混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。
三、GBSS活性计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本质量计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS活性（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V测：测量体积，0.78mL；V反总：反应体积，0.62mL；V提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；ε：NADPH消光系数，6.22×10^-3mL/(nmol^.cm)；d：石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
实验实例：

1. 取0.1g肝脏加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A2-A1=0.19-0.178=0.012，按样本质量计算：GBSS活性（U/g 质量）=43.2×ΔA÷W=5.184 U/g 质量。

2. 取0.1g柳树加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A2-A1=1.919-1.915=0.004，按样本质量计算：GBSS活性（U/g 质量）=43.2×ΔA÷W=1.728 U/g 质量。

参考文献：

1. Jiang H, Dian W, Wu P. Effect of high temperature on fine structure of amylopectin in rice endosperm by reducing the activity of the starch branching enzyme[J]. Phytochemistry, 2003, 63(1): 53-59.

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