WB实验过程中常见条带问题分析解决方法

WB实验过程中常见条带问题分析解决方法

一、除了目的蛋白条带外有很多条杂带

1. 一抗抗体差异，部分不常见的分子抗体是多克隆的，杂带比较多。

2.一抗4℃孵育过夜时，如果一抗的孵育浓度较高，也容易出现杂带。 一般可按抗体说明书来设定稀释浓度。

3.二抗孵育时间过长或者二抗浓度过高也会导致杂带增多。一般二抗规定的孵育时间为室温1-2小时， 一般1小时足矣， 时间过长易出现非特异性条带； 二抗一般1：10000稀释。

4.一抗与二抗之间TBST洗膜时间较短，次数较少，常规应该洗三次，一次10min。

5.在封闭， 或是一抗二抗孵育的这种wb中比较关键的步骤都会用到TBST，其配方中比较关键的是Tween-20，是一种非离子型表面活性剂，对抗原抗体蛋白有保护作用， 也可以减少抗体对抗原的非特异性作用， 用于洗脱未结合的抗体，减少非特异性结合， 一般用量是1ml/L。

6.一般的抗体只能识别抗原蛋白中的线性序列结构表位即一级结构，煮蛋白目的为打开折叠的空间结构， 缓冲液中含有的SDS可断裂蛋白分子内和分子间的氢键， 使分子去折叠， 破坏蛋白质分子的二级和三级结构，若煮蛋白时间较短， 或者loading buffer有问题， 都会影响抗原抗体结合， 影响最后的显影结果。对于容易形成多聚体的蛋白，可以延长煮样时间， 99℃10min。

7.有时候目的蛋白在所测蛋白样品中是低表达蛋白，显影后重影也较多。

8. 体内表达的蛋白具有很多种修饰形式， 如甲基化、乙酰化、磷酸化等， 会影响结果，可以参考抗体网站信息及查阅文献来解决。

9. 蛋白样本降解， 也会造成杂带过多（比原来位置低的地方出现主带， 也会出现一些其他的带， 所有的条带都比正常的低且模糊不清），排除此种原因需注意在冰上裂解蛋白， 时间不要太长， 裂解液中加入蛋白酶抑制剂， 定量后及时煮样， 使其稳定，并保存于-20℃中，煮好的样品尽量减少在室温中的时间。

二、WB条带背景有黑点点

脱脂牛奶封闭时，脱脂奶粉颗粒未完全溶解。

三、WB条带显影无条带

1.比较简单的原因可能是目的蛋白所出现的分子量位置与说明书介绍的分子量位置差距较远， 切胶时切掉了， 在第一次跑某目的蛋白时， 可采取整膜转，看一下能否跑出条带。当然蛋白分子量偏高或偏低也有可能是因为选择的胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应所致。

2.一抗的浓度较低， 可适当增加一抗抗体浓度，或者更换效价比较高的一抗。一抗孵育的时间可适当延长， 注意不要太长， 一抗蒸发会干膜。在实际操作中， 如果用透明封口袋封膜， 最后孵一抗的效果会比用孵育盒强， 因为既可以减少一抗的用量， 又可以防止膜在抗体表面漂浮， 孵育不充分， 但是要注意用封口袋封膜时， 排尽气泡， 切不要一次封太多张膜， 膜重叠在一起也会导致孵育不充分。同时也要注意一抗保存要得当，否则效价会降低。

3. 当所测蛋白样品中目的蛋白的含量很低时， 也会出现无条带， 注意增加上样量， 设置好阳性对照以利于结果分析， 提蛋白时也要注意操作时间， 冰上操作，在裂解液中加蛋白酶抑制剂，提的细胞或者组织样品越新鲜越好。

4.转膜问题。转膜的时间和电压或者电流强度要依据目的蛋白的分子量来设定。时间过短， 电压过低， 没转上或是时间过长， 电压过高转过了， 都会影响最后的结果。可以做预实验或者根据前辈的经验来设定转膜条件。当目的蛋白分子量过小时（10KDa），可以选择两张膜叠在一起转，选用小孔径的膜，缩短转膜时间。当然， 转膜时电极插反或者膜和胶在转膜夹的位置摆放不正确，或者转膜夹与转膜芯方向不对，膜转反了会直接导致实验失败。

5.洗膜时时间过长次数过多也会影响结果。

6. 发光液失效， 发光液过期或者未注意避光， 记得现配现用， 若样品中目的蛋白表达量较低，可适当延长显影时间。

7. Tween-20浓度过高时， 也会干扰抗体相互作用， 洗去PVDF膜上的目的蛋白。

8.最不应该犯的错误是一抗和二抗种属不搭配。

四、WB条带有边缘规则白点

1. 转膜时PVDF膜与胶之间气泡未赶净。转膜过程要尽量去除气泡， 使膜、滤纸和胶紧密结合。

2.用封口袋孵一抗时，未除净气泡。

五、显影后胶片背景太高

1. 洗膜不充分。

2. 二抗浓度过高，降低二抗浓度。

3. 一抗特异性不强。

4. 曝光时间过长，适当减少显影时间。

5. 封闭不充分，延长封闭时间或者更换封闭液。

六、WB条带歪斜

1. 最可能出现的问题是凝胶制备的问题， 灌胶时胶不平整。例如APS与TEMED加的量过多， 凝胶凝固速度过快。加完各组成成分后没有很好地混匀， 浓度不一。灌胶后用醇类压胶效果好于蒸馏水， 用蒸馏水压胶后， 可轻微上下磕桌面，减小水的表面张力。在平整的桌面上配胶。配胶时室内温度也很重要，太低凝固时间较长， 分离胶漏的较多， 胶面较低， 蛋白不能充分分离。室内温度过高胶凝固时间过快， 不易平整。拔梳子时要左右手用力均匀， 速度不要太快， 否则上样孔扭曲。每个孔上样量要一致。另外， 如果配置好的胶板有气泡或者配胶时用的水有杂质等不溶性颗粒，也会影响跑胶， 导致条带扭曲。

2.转膜夹老旧，海绵变薄，三明治结构不紧凑。

3.如果整个泳道左右歪曲， 可能是上样时多余的胶孔没有用空的loading buffer补齐。

4.电泳时玻璃板未夹紧漏液，电压不稳，溴酚蓝的线在胶上有可见扭曲。

七、条带中央区发白

上样过多，导致信号瞬间淬灭。

八、左右孔道条带粘连

1.上样量过多，或者分离胶与浓缩胶间有空隙。

2.由于电泳完成后没有及时转膜，样品弥散。

九、显影时出现不均一的背景

在一抗、二抗、封闭、或者洗膜时可能出现了干膜。

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