一、石蜡冰冻切片TUNEL凋亡荧光实验原理：

dUTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL) 法检测细胞凋亡的原理是当细胞发生凋亡时,DNA内切酶被激活，核小体间的基因组DNA被切断，暴露的3-0H可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上带有荧光素FITC标记的dUTP,从而可以通过荧光显微镜进行检测。

二、石蜡冰冻切片TUNEL凋亡荧光实验意义：

1.TUNEL法是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。

2.可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞等进行细胞凋亡检测，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3.操作简便快捷，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

三、TUNEL凋亡荧光实验步骤:

1.石蜡切片TUNEL显色法:

①石蜡切片常规脱蜡至水，脱蜡剂= =甲苯，至水剂乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液379C反应15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室温固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封闭液(3%H202)室温封闭10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥参考使用试剂盒的说明书配制适量的TUNEL检测液，其中含有TdT酶、荧光标记液、TUNEL检测液;

⑦样品上加入适量TUNEL检测液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧选择是否用DAPI复染细胞核;

⑨使用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下进行观察。

2.冰冻切片TUNEL显色法:

①新鲜组织经处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5~6 um;

②防脱玻片，贴片，室温阴干约12h;③4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室温固定10 min,

PBS漂洗3x5 min;

④浸入封闭液(3%H20O2) 室温封闭10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中)，室温通透30 S-2 min;

⑥参考使用试剂盒的说明书配制适量的TUNEL检测液，其中含有TdT酶、荧光标记液、TUNEL检测液;

⑦样品上加入适量TUNEL检测液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧选择是否用DAPI复染细胞核:

⑨使用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下进行观察。

四、结果展示

实验完成周期及交付标准

1.实验周期: 1-2周

2.交付标准:蜡块、切片、染色图片.实验报告(实验步骤、试剂、耗材等)

需确认的信息

1.样本的种属

2.样本的类型(固定的组织or蜡块or切片)

3.是否提供试剂盒

4.拍照要求

实验代做服务：