探针合成实验步骤
探针是- -小段单链DNA或者RNA*片段(大约是20到500 bp)， 用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(通常用磷-32)、萤光染料或者酶 (如辣根过氧化物酶)标记成为探针。
实验材料 | 基因 |
试剂、试 剂盒 | 转录缓冲液DTT RNA酶抑制剂CTP ATP S-UTP乙酸铵乙醇 |
仪器、耗 材 | 水溶锅、离心机、培养箱、烘箱 |
实验步骤 | 1.在一个含SP6. T3或T7启动子的载体中，插入目的基因。在编码序列下游酶切使质粒呈线 性。DNAL以酚/氨0仿抽提， 乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以无菌水重溶沉淀至1 ug/ul。 2.室温配置如下反应混合液(总体积20μl) : (1) 4.0 ul 5x转录缓)冲液 (2) 0.2 ul 1 mol/ DTT (3) 60 U RNA酶抑制剂 (4) 1.0 ul三种10 mmol/l NTP中的每-种 (5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA (6) 10.0μ ζ[35s] UTP (7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶 (8) 37*C温育30 min,再加16 U聚合酶并于37 °C温育40 min。 3.在反应混合液中加入: 60 U RNA酶抑制剂，20 μl 10 mg/ml的载体RNA和1.0μl酶1,于37°C温育10 min以除去摸板。 4.往反应混合液加入以下液体: 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 无菌水和10 μI3 mol/l乙酸钠，取出1 ul测定其cpm/ul值。 5.加36.4μ7.5 molM的乙酸铵于反应混合液(终浓度2 mol/)加50~100 ug tRNA载体和272ul冷无水乙醇，置干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的话可重复此步。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。 6.确定其cpm/μl值， 并计算掺入百分比，核糖核酸探针应于2~3天内使用。 (70%到90%的标记掺入，结果可得70~90 ng标记的RNA) |
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