脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒 返回列表页

脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化GSH 还原DHA 生成AsA 和GSSG，调控细胞AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱gan肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。

测定原理：

DHAR 催化GSH 还原DHA 生成AsA，通过测定DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5ml 蒸馏水充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5ml 蒸馏水充分溶解。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1ml 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

血清等液体：直接测定。

DHAR 测定操作：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。

试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

在 1ml 石英比色皿中依次加入 100μl 试剂三、100μl 试剂四和 700μl 试剂二，最后加 100μl 上清液，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△A=A2-A1。

DHAR 活性计算公式：

按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T

= 92×△A ÷Cpr

按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 92×△A ÷W

按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 92×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm；109：摩尔分子换算成纳摩尔分子；d：比色杯光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，1ml=0.001 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，100μl =0.1ml； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；W，样本质量，g；T：反应时间，2 min。

脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。