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果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP)试剂盒说明书

分光光度法 50 管 48 样

果糖-1,6-二磷酸酶试剂盒光合系列

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

果糖-1,6 二磷酸酶又称果糖 1,6 二磷酸酯酶，催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。

测定原理：

FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下测定NADPH 增加速率，即可计算 FBP 活性。

组成：

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 40ml 试剂四充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存； 试剂二：液体 18μl×1 瓶，4℃保存；临用前加入 2.5ml 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5ml 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

自备仪器和用品：

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

样本的前处理:

①总FBP 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎

3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体FBP 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g离心 10min，取上清用于测定胞浆 FBP 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中FBP 酶活性。

建议测定总FBP 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBP，则按照步骤②提取粗酶液。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟

3、加样表：

将上述试剂按顺序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录反应 1min 后吸光度A1 和反应 6min 后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

FBP 活性计算:

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.5×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.1 ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。

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