使用方法 | 1. 细胞裂解 组织样本: Trizol用量:每 50-100 mg 组织加 1 ml Trizol,样品体积不应超过 Trizol 体积的 10%。 1) 将动物或植物组织切成小块,在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。 2) 将研磨好的组织粉末快速转入装有 1 ml Trizol 的 2 ml 离心管中,在涡旋振荡器上迅速振荡混匀,置于冰上, 待所有的样品研磨完。 3) 裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等,匀浆后仍会存留有不溶物质,可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min,然后吸取上清至一新的离心管中。 细胞样本:1) 贴壁细胞:吸尽培养液,每 10 cm2培养面积(6 孔板单孔或 35 mm 平皿)加入 1 ml Trizol,用加样器吹打数 次,以确保细胞*裂解,然后转移至离心管中。 注 : Trizol 的 使 用 量 应 由 培 养 皿 表 面 积 决 定 , 而 非 由 细 胞 数 目 决 定 。 Trizol 量 不 足 可 能 导 致 提 取 的 RNA 中 有 DNA 污 染 。 2) 悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,每 5-10×106动植物或酵母细胞,或每 1×107细菌细胞加入 1ml Trizol, 用加样器吹打,使其*裂解,然后转移至离心管中。 注 : 添 加 Trizol 前 切 勿 洗 涤 细 胞 , 以 免 RNA 降 解 。 必 要 时 可 以 用 匀 浆 器 来 裂 解 某 些 细 菌 或 者 酵 母 细 胞 。 2. 液相分离 1) 裂解产物于室温放置 5 min,使核酸-蛋白复合物*分离。 (注:此时样品可在-80℃长期保存。 ) 2) 每 1 ml Trizol 加入 0.2 ml 氯仿,盖紧管盖,剧烈振荡 15 s,室温放置 2-3 min。 3) 4℃ 12,000 x g 离心 15 min,样品会分成三层:桔黄色的下层有机相,中间层和无色的上层水相。 4) 吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管中,吸取水相的体积为所用 Trizol 试剂的 60%。 3. RNA 回收 1) 按照每 1 ml Trizol 的最初使用量加入 0.5 ml 异丙醇,颠倒数次混匀,室温放置 10 min。 2) 4℃ 12,000 x g 离心 10 min,弃除上清,可见胶状的 RNA 沉淀。 3) 按照每 1 ml Trizol 的最初使用量加入 1 ml 75%乙醇,颠倒数次混匀,洗涤沉淀。 4) 4℃ 12,000 x g 离心 5 min,弃除上清。 5) 室温倒置 5-10 min 晾干或真空抽干(不要使用真空干燥离心机,以免 RNA 过干,难以溶解) 。 6) 加入适量(如 25ul) DEPC-ddH2O 或 TE 缓冲液,用加样器吹打数次溶解 RNA。 7) 通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测,确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。 8) 所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存,避免反复冻融。 |