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DNA实验技术：化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法
2013-8-22 阅读(2059)
（一）原理
DNA 在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm 波长处有zui大吸收。DNA 在40-400μg 范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
（二）试剂及器材
1. DNA标准溶液
准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐，以0.01mol/L NaOH 溶液配成200μg/mL 的溶液。
2. 测定样品溶液
准确称取干燥的DNA 制品，以0.01mol/L NaOH 溶液配成100-150μg/mL 的溶液。若要测定RNA 制品中的DNA 含量，样品中至少要含有DNA 20μg/mL 才能进行测定。
3. 二苯胺试剂
称取1g 二苯胺， 溶于100mL 的分析纯的冰乙酸中，再加入60%以上的过氯酸10mL,混匀待用。临用前加入1mL 的1.6%乙醛，配好的试剂应为无色。
4.分光光度计
（三）操作方法
1. 制作DNA 标准曲线：取12 支洁净干燥试管按表1 加入试剂：
表1 DNA标准曲线制作
按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h,冷却后于595nm 波长处以1,2 管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。取两管的平均值，以DNA 的含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品DNA 含量测定：取2 支干净试管按表2 加入试剂，其它操作同上。
表2 样品DNA 含量测定
待测溶液中的DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内。
3. DNA 含量计算：以样品的光密度，从标准曲线上查出相对应DNA 含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。
