上海北诺生物科技有限公司

中级会员·14年

联系电话

15800960770

您现在的位置： 首页> 公司动态> DNA实验技术：多药抗药基因的表达实验
产品分类品牌
中级会员·14年
联系人：
周经理 刘经理
电话：
021-57730393
手机：
15800960770
传真：
86-021-61496710
地址：
上海市徐汇区宜山路520号中华门大厦18楼D座
个性化：
www.bnbiotech.com
网址：
www.bnbiotech.com
在线咨询给我留言

扫一扫访问手机商铺

DNA实验技术：多药抗药基因的表达实验

2013-7-27　　阅读(1461)

分享：

多药抗药基因的表达实验

标签： 抗药 基因

多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测特定基因的过度表达。

实验方法
  • PCR扩增法
实验方法原理 大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。
实验材料
RNA
试剂、试剂盒
PBS 氯仿 异丙醇 萘酸 异硫氰酸肽 十二烷基肌酸钠 构橼酸钠 乙酸钠 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶
仪器、耗材
离心机 紫外分光光度计 琼脂糖凝胶电泳 PCR仪
实验步骤

一、细胞总RNA提取

1.  收集约5×107个细胞，冷PBS洗涤。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。

3.  加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。

4.  取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。

6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A260/A280应为1.8~2.0）后备用。

二、反转录及PCR扩增

1.  引物
 


2.  取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中，42℃保温30 min 进行反转录，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 终止反转录。

4.  接着在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，对cDNA上的目的片段进行PCR

5.  94℃预变性2 min，然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增35个循环。

6.  zui终在60℃保温7 min，以保证产物充分延伸。

7.  取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下照相，与mdr-1 cDNA阳性对照，等位的DNA条带为阳性，反之为阴性。

上一篇：DNA实验技术：甲醛变性电泳检测RNA完整

下一篇：DNA专题：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳

会员登录

×

请输入账号

请输入密码

=

请输验证码

收藏该商铺

X
该信息已收藏！
查看我的收藏夹设置标签
标签：
保存成功

(空格分隔,最多3个,单个标签最多10个字符)

常用：

提示

X
您的留言已提交成功！我们将在第一时间回复您~
产品对比 二维码 在线交流

扫一扫访问手机商铺

对比框

在线留言