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DNA专题：真核细胞基因组提取
2013-7-27 阅读(1480)
一. 实验目的及背景
高等动物，高等植物的基因组相当庞大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有1.4×108个碱基对，水稻基因组有1.4×109个碱基对。真核细胞基因组中，约1万－1.5万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高--不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好--以便有足够量用于分析；基因组相对完整--断裂的基因组以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。
真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；zui后纯化出DNA，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以zui大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。
二．实验试剂及材料
材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。
试剂：液氮
CTAB抽提缓冲液：2%CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基*基溴化铵），1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿：异戊醇（24:1）
异丙醇 70％乙醇TE buffer
三．实验方法
1．取0.5g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干。
2．植物材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中。
3．加入液氮速冷，研磨成细粉（越细越好）。
4．在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，60℃保温1小时。
5. 15000rpm，离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
6．加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀抽提至水乳胶融状。
7. 15000rpm，离心10分钟。
8．上清转入另一个新的离心管中。
9．加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min―1hr，缓缓混匀DNA成絮状折出。
10．15000rpm，离心10分钟，弃上清。
11．DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。
12．加入400μl TE buffer溶解DNA。
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