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AP融合蛋白的亚克隆和表达
2012-12-18 阅读(1615)
1．使用来自筛选出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含与AP融合表达载体的克隆位点相对应的限制性酶切位点的寡核苷酸引物，进行PCR反应。
2．通过琼脂糖凝胶电泳检测正确大小的扩增产物。选择相应方法对PCR产物进行纯化。
3．用对应于克隆位点的限制性内切酶消化PCR产物，使用标准的方法将此产物连接到相同酶切后的AP融合蛋白表达载体中。
4，通过标准的方法将连接产物转化入大肠杆菌中，铺到含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单克隆，利用标准的方法（如限制性酶切或PCR）鉴定是否有插入序列。
5，在LB+100ug/m1氨苄青霉素培养基中，过夜培养少量（约5m1）的阳性克隆菌液。以l/100接种于适合所用诱导系统的表达培养基中。
6．用适合所用的诱导系统的方法培养细胞并诱导表达。7500g离心收集细胞，并弃去上清液。将细胞沉淀在一20℃冷冻超过4小时，或在酒精/干冰混合物上冷冻10分钟。
7．轻轻地将细胞重悬于TE+PMSF缓冲液中以释放胞质蛋白。 离心（7500g）沉淀细胞并收集上清液。
8．用一个因所用标签而异的方法进一步纯化融合蛋白。这将使融合蛋白的定量变得更容 易，并能除去可能影响酶解检测的杂质蛋白。但是，如果AP融合蛋白的表达水平较 高，也可以直接使用胞质裂解原液，因为检测中已含有一个有效的亲和性纯化步骤。9．用SDS—PAGE分析胞质蛋白和一系列浓度的基准纯化AP。用凝胶光密度测量法（gel densitometry）将样品中的AP融合蛋白水平定量。
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