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转移到麦芽糖结合蛋白中分析
2012-12-18 阅读(1548)
麦芽糖结合蛋白ELISA的方法与以前论文所述一致[1Sj，除了从大肠杆菌中释放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我们发现，使用商业性的去垢剂（Pierce公司的B-PER抽提试剂）较溶菌酶能更简单有效地裂解细菌细胞。3 ml培养基中的经诱导的细胞先通过沉降，再通过含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重悬。于室温下放置20分钟后，离心5分钟以除去细胞碎片，将上清转移到一个新的管中。裂解物于一70~0冻存，当用于ELISA反应时按1：50稀释。
在几个实验项目中，我们发现麦芽糖结合蛋白ELISA反应中的强信号经常能够代表肽段与所研究的受体的高亲和性。当然，对于严格的分析肽段的性质而言，zui终的化学合成肽段是必要的。如果是大规模的筛选克隆，先采用标准步骤进行克隆黏附分析，可以为后面的ELISA分析提供更少的克隆集合。
我们发现在发现高亲和力的肽配体的过程中，使用噬菌体载体展示和乳糖抑制物/冠状二聚体展示存在着很大的共性。通常，通过两种方法筛选得到的是相似家族的肽段。在某些情况下，我们发现其中的某种方法对于某个特定受体的初始特异性肽的搜寻或从一个序列家族中筛选zui高亲和力的变异体要较优于另一种方法。这可能与所展示肽段的定向不同或者与两种方法的生物约束因素不同有关。然而，无论是使用哪种系统，zui有效的筛选高亲和力配体方法是先分离出至少一个能与靶标结合的序列家族，然后通过增加严谨性，筛选含有从先导肽衍生出的大量变异体的次的库。通过这种多步的方法，就可以有效地探索到单个大库无法展示的序列空白。
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