50T 草地贪夜蛾弹状病毒探针法荧光PCR试剂盒

产品简介：

草地贪夜蛾弹状病毒(Spodoptera Frugiperda Rhabdovirus，SfRV)，是一种线性负义单链 RNA 病毒，其基因组长度为 11000 nt~12000 nt，该病毒颗粒通常为180 nm~200 nm 长，直径为 70 nm~80 nm 的子-弹状。草地贪夜蛾弹状病毒可以通过昆虫体液或环境中的接触传播，也可以通过亲本进行垂直传播。该病毒还能够在草地贪夜蛾的细胞系中持续感染。它作为一种能感染危害玉米、水稻等作物害虫的病毒引发了农业及生物学界的关注。因此快速灵敏诊断草地贪夜蛾弹状病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测草地贪夜蛾弹状病毒的含内参试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于制备标准曲线和用作扩增对照，排除假阴性结果。

4.含识别内源性内参的引物和探针，便于排除 RT-PCR 假阴性结果。

5.特异性高，靶分子的引物和探针是根据草地贪夜蛾弹状病毒 RNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 RNA 发生交叉反应。

6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

7.本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 RT-PCR 反应。

8.草地贪夜蛾弹状病毒探针法荧光PCR试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

探针法 qRT-PCR 缓冲液、探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2、荧光PCR 专用模板稀释液、通用内参(1E4 拷贝/μL)、草地贪夜蛾弹状病毒 qRT-PCR引物-探针干粉（含内参引物探针）、草地贪夜蛾弹状病毒 qRT-PCR阳性对照(1E7 拷贝/μL)、使用手册

自备试剂

样品 RNA。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以阳性对照 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。

1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1，0。

2.在 0 号管中加入 280 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，35 μL 本试剂盒提供的外源性内参，震荡一分钟混匀。外源内参的浓度为 1E4 拷贝/μL。

3.在各管中加入 45 μL 荧光PCR 专用模板稀释液。

4.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线阳性样品，各样品中外源内参浓度均为 1E3 拷贝/μL。放冰上待用。如需降低外源内参浓度，可在第 2 步时减少加入量。

二、样品 RNA 的制备

6.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是制备 PC（样品制备阳性对照），一个是制备 NC（样品制备阴性对照）。可以用确认是阳性的样本作为阳性对照，用确认是阴性的样本作为阴性对照。

7.用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qRT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

8.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 RT-PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 5 第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：

成分样品管

N+2 个RT-PCR

阴性对照标准曲线样品管

（1-6 管）

探针法 qRT-PCR 缓冲液各 10 μL10 μL各 10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL

草地贪夜蛾弹状病毒 qRT-PCR

引物-探针混合液(含内参引物和探针)各 4 μL4 μL4 μL

N+2 个待测样（含内源性内参）各 5 μL不加不加

超纯水不加5 μL不加

第 5 所得标准曲线样品稀释液

（含内参，1-6 号）不加不加各 5 μL（2 号样

到 2 号管，3 号样

到 3 号管…）

10.盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

四、数据处理

11.阴性阳性判断：没有 Ct 读数，或 Ct 大于 40 判为阴性结果。有 Ct 读数，Ct 值小于 40，荧光信号有对数增长，有典型扩增曲线判为阳性结果。每个样本需要对FAM 通道和 Cy5 通道的结果分别进行判定，得到两个结果。

12.实验有效性判断：如果扩增阳性对照或制备阳性对照 FAM 通道结果为阴性则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，重做扩增或制备或跟仪器和试剂厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照 FAM 通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，直到污染消除。如果阳性对照和阴性对照正常，则进入下一步分析样本的有效性。

13.样本有效性判断：如果样本 FAM 通道的结果为阳性，则无论内参通道的结果是阴性还是阳性，样本的结果均有效。如果样本结果为阴性，内参通道结果也为阴性， 则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。

14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，分别以阳性对照 FAM 通道和内参通道的 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照 FAM 通道读数的标准曲线为斜线，r2 必须大于 0.95，内参通道读数的标准曲线为一条跟 X 轴平行的横线。再以待测样品的 Ct 值从阳性对照FAM 通道读数的标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

15.如果用于定性实验，对待测样品，如果其 FAM 通道的 Ct 没有读数、或 Ct 大于或等于 40 则均为阴性，如果小于 40 则为阳性。对任何 FAM 通道结果为阴性的待测样本，如果其对应的内参通道也为阴性，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。

选择我们的草地贪夜蛾弹状病毒探针法荧光PCR试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！