详细介绍
SP6体外转录试剂盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒,它利用含有
SP6 启动子的模版 DNA,以 NTP 为底物,从 SP6 启动子下游开始合成与模版
DNA 中一条链互补的 RNA,简单快速获得大量的 RNA 分子。
本产品具有下列
特点:
1. 即开即用,用户只需提供含 SP6 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实
验,不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液,减少加样次数,避免了操作误差,增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA,也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的*长度在 20nt 到 2000 nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化,每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。
得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-
蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰(RNAi)等实验。
规格及成分 成份 编号 塑料袋包装
转录预配液(2×) 91107A 0.5 mL
阳性对照 DNA
(1.3 kb 片段) 91107B
20 μL
(10 ng/μL)
SP6 RNA 聚合酶混合液 120307 50 μL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手册 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 如果需要去除转录产物中的 DNA 模板,则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱
和酚、氯、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇(均可从本公司另购)
SP6体外转录试剂盒使用方法 一、制备 DNA 模板
PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点。
一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA,则必须先用适当的限制性
内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 SP6 启动子。如
果模板是 PCR 产物,则可以在设计引物时将 SP6 启动子序列(5’ATT TAG
GTG ACA CTA TAG AGN G 3’)加上,转录其实是从 3 端 G AGN G 中
的*个 G 开始。如果是将 DNA 片段克隆到载体上,则需要选择有 SP6
启动子的载体,并且克隆位点必须位于 SP6 启动子下游。三是需要转录的
DNA 序列的下游端zui不要是 3’突出。如果是 3’突出(如选择了 Pst I
来线性化质粒),则zui用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板
中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A,
因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染,所以在用作模板前,zui采
取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温,然后电泳
检测 RNA 是否被降解,以此判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中,在室温下(不是在 4℃下)按次序
加入下列成分:
成分 加入量 备注
DNA 模板 X uL
总量在 50 ng-1 ug(如果模板
是 PCR 片段,建议用 50 ng 左
右;如果模板是质粒 DNA,建
议用 1 ug 左右;如果用本产品
提供的阳性对照,建议用 4 uL)
SP6 转录预配液(2×) 10 uL
室温时使用,以免精胺将 DNA
模板沉淀下来
SP6 RNA 聚合酶
混合液
1 uL
本成分还含其他促进剂,所以是
混合物
RNase-free 水 补水到 20 uL
注:此为 20 uL 反应体系的用量,对其他反应体系,各成分的用量可以按
比例增减。如果需要标记 RNA 探针,则需要订购 NTP 分开的试剂盒。如
果需要得到加帽 RNA,则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种
加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意:延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 SP6 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注:若需进一步去除 DNA 模板,可参考下列操作步骤,但所用试剂需另行购买,
本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase(CAT#:90903;
3-5 U/uL)。
2. 37℃保温 15-30 分钟。
3. 补水到 100 uL。
4. 用等体积(100 uL)的 Tris 饱和酚-氯抽提一次去除残留的 DNase 和
RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂(CAT#50903;用前需要摇晃
混匀),振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟,弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇,震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟,弃上清。
7. 短暂离心数秒,用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟,所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free
水中后立即使用或放-80℃长期保存。
答客问
1、没有 RNA 产物。zui常见原因是模板有 RNase 污染,可用纯化的 RNA 跟模
板 DNA 一起保温,再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor
用量,本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor,如果模板 RNase
污染严重,可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。zui常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的*个和第二个碱
基zui都是 G,在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。
可以改用 SP6 体外转录试剂盒(启动子也必须改成 SP6 启动子)。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样,有不依
赖于模板的加尾功能,zui多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。
如果 RNA 长度比预计的长很多,使用的模板又是质粒 DNA,则可能是质粒
DNA 线性化不*。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP,则得到的 RNA 是三磷酸,体外转
录时如果保温时间太长(如 12 小时),则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。
如果在转录体系中加入 GMP,则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP,所得
RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA?需加入带帽 NTP 类似物即可,本公司提供 5 种供选择
(产品编号 130694-130698)。
关联产品 T7 体外转录试剂盒(CAT#:91106)、T3 体外转录试剂盒(CAT#:91108)
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