免疫组化技术服务

工作原理：辣根过氧化物酶（HRP）的分子量（40000），它不会遮盖抗原的结合部位，具有较高活性及特异性，可溶性佳，生成的产物不扩散，可作用于多种底物，产生不同颜色且HRP穿透力强，易进入细胞内。DAB在 H2O2存在的情况下，可以作为HRP的电子供体，产生褐色的不溶颗粒，可作为显色的试剂。
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试剂内容：
 名称    规格
1、0.01mol/L pH6.0枸橼酸盐缓冲液  1L
2 、PBS缓冲液  2L
3、 广谱二抗  3mL
4 、30%H2O2  10 mL
5 、DAB显色液I  0.6mL
6 、DAB显色液II  0.6mL

自备试剂：无水乙醇、苏木素。
 

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操作步骤：
1、60℃常规脱蜡至水后，将石蜡切片先后浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min。然后逐级降浓度酒精入水，每次3-5 min。
① * 3－5min
② 90% 酒精 3－5min
③ 85% 酒精 3－5min
④ 75% 酒精 3－5min
⑤ PBS洗涤3次 每次5 min
2、热修复抗原： 将切片置于0.01mol/L pH6.0枸橼钠缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次，置于室温自然冷却。0.01 mol/L  pH7.0左右的PBS洗涤3次，每次5 min
3、消除内源性过氧化物酶：用3% H 2 O 2 室温孵育 5-10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗涤2-3次，每次5 min；
4、滴加一抗： 滴加适当稀释的一抗到切片上，37℃孵育1小时左右或者4℃过一夜， pH7.4的PBS洗涤3次，每次5 min 。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
5、加入广谱二抗，37℃孵育1小时，取出后PBS洗涤3次，每次5 min。
6、DAB显色： 取DAB显色液I及II各50微升加至入1mL的水中，配成DAB工作液，滴加到切片上，室温显色，镜下控制反应时间。若无背景出现则可继续显色。蒸馏水充分洗涤以终止反应。
7、观察显色后自来水冲，苏木精复染1-2min，，自来水冲10min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，干燥，分析拍照