细胞样本免疫荧光（ICC）---双标

1. 原理

    免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞内的相应抗原（或抗体）。在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术分直接法、间接法和补体法，zui常见的为间接法。

    在同一细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色，称为免疫荧光双标。用未标记的两种特异性*抗体孵育细胞，洗去多余的*抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性*抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与*抗体的种属相匹配。

2. 实验步骤

（1）在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；
（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min；
（3）用0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
（4）PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

（5）在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；
（6）吸水纸吸掉封闭液，不洗，同时滴加两种一抗混合液并放入湿盒，4℃孵育过夜；
（7）PBST浸洗爬片3次，每次5 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗混合液，湿盒中20－37℃孵育1 h；

（8）PBST浸洗爬片3次，每次5 min；

（9）滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行复染核，PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI；（10）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片；

（11）在荧光显微镜下观察。

3. 注意事项

（1）两种一抗要来源于两种不同的动物；

（2）二抗用两种不同荧光信号标记，且各自信号相互不干扰或干扰性小；

（3）荧光染色后一般在1 h内完成观察，或于4℃保存4 h，时间过长，会使荧光减弱；
（4）每次试验时，需设置以下三种对照：

     阳性对照：阳性血清+荧光标记物
     阴性对照：阴性血清+荧光标记物
     荧光标记物对照：PBS+荧光标记物；

（5）抗体浓度和孵育时间需要事先摸索。

注意事项： 

1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上； 

2.取材切面要平整，厚度不宜超过2mm； 

3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。