Western Blot 实验出现非特异性条带原因

实验结果出现非特异性条带的可能原因有①细胞传代次数过多，蛋白表达不同②体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等③蛋白样本降解④检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白⑤一抗浓度过高⑥二抗浓度过高产生的非特异性结合⑦抗体未经纯化⑧目标蛋白形成多聚体。

相应的处理方法是 ① 使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行实验②参考文献，使用试剂使样品去甲基化、磷酸化等来证明翻译后修饰 ③ 在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂 ④ 查阅其它文献报道，或BLAST搜寻，使用况明书推荐的 细胞株或组织 ⑤ 降低抗体浓度或缩短孵育时间 ⑥ 降低抗体浓度，加入二抗对照(不加一抗) ⑦ 使用亲和纯化的抗体，减少非特异性条带 ⑧ SDS-PAGE 电泳加样前煮沸10分钟而不是5分钟，使蛋白充分解聚。