酶联免疫试验（ELISA）在不同孵育条件下的试验结果

【摘要】  目的 了解ELISA在干、湿孵育条件下的试验结果。方法 设定4种干、湿孵育条件，以双抗体夹心法测定不同浓度HBsAg血清样品OD值。结果 结果显示HBsAg浓度较高时，在不同孵育条件下，OD值差异不大，浓度较低时则有明显区别。结论 ELISA在湿孵育条件结果更可靠。

【关键词】  ELISA;湿孵育条件;OD值

ELISA因其结果稳定、实验条件相对要求较低，广泛应用于多种血清学指标检测，在基层实验室普及很广。目前市售试剂盒配置齐全，只要操作人员加样准确，按试剂盒要求操作，一般较高浓度样品均能得到满意结果。但对于低浓度或处于临界值样品，孵育条件对结果的准确性可能有影响。为此，笔者设定了4组干、湿孵育条件，选择不同浓度HBsAg样品进行ELISA试验，观察各样品OD值，以遴选出*孵育条件。

    1  材料与方法

    1.1  材料  HBsAg血清样品来自本院门诊病人。ELISA法HBsAg检测试剂盒，由上海科华生物实业有限公司生产，批号20080810，效期半年。德国HUMAN2000型酶标仪。

    1.2  方法

    1.2.1  样品准备  将金标法测得HBsAg阳性的多份病人血清样混合均匀，以生理盐水稀释成6个不同浓度样品后备用。

    1.2.2  孵育条件  设4组孵育条件。（1）抗原抗体结合反应和显色反应均在37℃湿盒中（湿式）中孵育；（2）抗原抗体结合反应在37℃湿盒中（湿式）中孵育；显色反应在37℃培养箱（干式）中孵育；（3）抗原抗体结合反应在37℃培养箱（干式）中孵育，显色反应在37℃湿盒中（湿式）中孵育；（4）抗原抗体结合反应和显色反应均在37℃培养箱（干式）中孵育。抗原抗体结合反应时间均为30min，显色反应时间均为20min。

    1.2.3  实验操作  加样、洗板、酶标仪读数、结果判定参考《临床检验管理与技术规范》［1］及试剂盒使用说明书操作。

    2  结果

    6份血清样品及阴性、阳性对照显色后按规定各加50μl终止液，振荡均匀置酶标仪上，以450/630nm双波长读取OD值。阴性对照以0.05计， 临界值=0.05×2.1，测定管OD/临界值≥1为HBsAg阳性，反之阴性。4种孵育条件各孔OD结果见表1。结果显示5#血清在第3组、第4组条件下HBsAg阴性，第1组、第2组条件下HBsAg阳性。表1  4种孵育条件下ELISA测定不同浓度HBsAg OD值

    3  讨论

    抗原抗体和酶促反应有许多影响因素，温度是重要因素之一，在反应达到zui适温度前，反应速率与温度增加呈正比关系。目前，IFCC和我国临床生化检验中推荐温度为37℃［2］，同时为保证测定结果的准确性，要求误差不能大于±0.5℃。在酶免反应中，酶标板各孔内及孔间升温达到37℃需要一定时间，如果传热媒介不同，升降温速率则不同，结果将产生差异。从本文的试验结果看，湿式孵育优于干式孵育，特别是对抗原抗体结合阶段影响较大，直接影响到低浓度样品的检测结果，这可能与水媒介传热均匀与快速有关。因此，建议酶免反应尽可能使用水浴箱，要求固相板放入水中，以减少受热不均。

【参考文献】
  1 陆永绥,张伟民.临床检验管理与技术规范.杭州:浙江大学出版社,2007，617.

2 周新,涂植光.临床生物化学和生物化学检验.北京:人民卫生出版社,2003，142.