细胞自噬染色实验的操作步骤与处理方法及注意事项！

百欧博伟生物：细胞自噬（autophagy）的染色实验通常依赖于荧光探针或抗体标记，以观察自噬体（autophagosome）或溶酶体（lysosome）的动态变化。以下是几种常用的细胞自噬染色实验步骤，包括MDC染色、LysoTracker染色和自噬检测试剂盒等方法。

一、MDC（Monodansylcadaverine）染色

原理：MDC是一种疏水性荧光染料，可选择性标记自噬体膜的脂双层结构。

步骤：

细胞处理：

将细胞接种于共聚焦培养皿或细胞爬片中，待其贴壁后，进行自噬诱导或抑制。

染色：

配制MDC工作液（终浓度50 μM，用无血清培养基或PBS稀释）。

吸去原培养基，加入MDC工作液，37℃避光孵育15-30分钟。

洗涤：

吸去染色液，用预热的PBS轻柔洗涤细胞3次（每次5分钟），去除未结合的染料。

观察：

立即用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察（激发波长335 nm，发射波长525 nm）。

注意：MDC染色需活细胞观察，避免固定（固定会破坏自噬体结构）。

二、LysoTracker染色（溶酶体标记）

原理：LysoTracker标记酸性细胞器，用于观察自噬体与溶酶体融合。

步骤：

细胞处理：

同MDC步骤，诱导或抑制自噬后，准备染色。

染色：

将LysoTracker Red或 Green（终浓度50-100 nM）用培养基稀释，避光条件下37℃孵育30分钟。

洗涤：

用PBS洗涤3次，去除多余染料。

固定（可选）：

若需固定，用4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤后封片。

注意：LysoTracker适用于活细胞或固定后细胞，但固定可能影响溶酶体酸性环境。

三、CYTO-ID® 自噬检测试剂盒（特异性标记自噬体）

原理：CYTO-ID® 是一种绿色荧光染料，特异性标记自噬体膜，不与溶酶体结合。

步骤（以试剂盒说明书为准，以下为通用流程）：

细胞处理：

诱导或抑制自噬后，用预热的PBS洗涤细胞1次。

染色：

加入CYTO-ID® 染色液（1:1000稀释于培养基或缓冲液），37℃避光孵育30分钟。

洗涤：

用1× Assay Buffer洗涤2次，每次5分钟。

核染色（可选）：

加入33342（1 μg/mL）染色5分钟。

观察：

荧光显微镜或流式细胞仪检测（CYTO-ID® Ex/Em=480/530 nm）。

优势：适用于活细胞、高特异性、可定量分析。

四、免疫荧光染色（LC3抗体标记）

原理：通过抗体标记LC3蛋白（自噬体标志物），区分LC3-I（胞质）和LC3-II（自噬体膜结合形式）。

步骤：

细胞处理：同前。

固定：4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤。

透化：0.1% Triton X-100处理10分钟，PBS洗涤。

封闭：5% BSA封闭1小时。

一抗孵育：抗LC3抗体（1:200-1:500稀释）4℃过夜。

二抗孵育：荧光标记二抗，避光室温1小时。

核染色：DAPI（1 μg/mL）染色5分钟。

封片观察：抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜观察LC3 puncta（斑点状结构）。

五、注意事项

对照设置：

阳性对照（自噬诱导剂如雷帕霉素、EBSS饥饿培养基）；

阴性对照（自噬抑制剂如氯喹）。

时间点优化：自噬是动态过程，需根据实验设计选择合适的时间点（如处理0、6、12、24小时）。

避免光漂白：荧光染料需避光操作，尽快观察。

定量分析：

使用软件统计荧光斑点数量或面积；

流式细胞仪定量CYTO-ID® 荧光强度。

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