人肺动脉内皮细胞的处理方法与培养步骤及应用研究！

一、背景

人肺动脉内皮细胞是提取于人肺组织的原代细胞系，血管内皮细胞主要作用是维持血管的动态平衡。此细胞能合成和分泌凝血和纤溶系统中的活化和抑制因子，同时也能合成和分泌影响着血小板粘附和聚集的某些介质。内皮细胞还可以释放具有调控细胞增殖和血管壁张力功能的分子。人肺动脉内皮细胞上的腺苷受体被脂多糖激活后，会引起参与急性肺损伤的病生理过程的IL-6的释放。许多此类以及其他的作用过程可以应用培养的细胞在体外研究进行研究，人肺动脉内皮细胞正是这类研究中普遍应用的细胞类型。

二、细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三、细胞处理方法

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

四、应用

用于香烟烟雾提取物经内质网应激CHOP信号通路促进人肺动脉内皮细胞凋亡研究：

明确香烟烟雾提取物是否经内质网应激CHOP信号通路促进人肺动脉内皮细胞凋亡,以及苯基丁酸（PBA）是否具有凋亡抑制作用。

方法：通过慢病毒转染重组RNA沉默HPAEC人肺动脉内皮细胞CHOP基因表达,将未进行CHOP基因干预的HPAEC人肺动脉内皮细胞及CHOP基因沉默的HPAEC-CHOP人肺动脉内皮细胞各自分为对照组（Ctrl组,常规培养不作特殊处理）、香烟烟雾提取物组（CSE组,培养基中加入10%香烟烟雾提取物）、苯基丁酸组（PBA组,培养基中加入5mmol/L的PBA）和香烟烟雾提取物联合苯基丁酸组（CSE+PBA组,培养基中加入10%香烟烟雾提取物以及5mmol/L的PBA）,各组细胞分别处理6h、12h、24h,收集后用于后续实验。通过透射电镜观察细胞内质网形态变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡比例,Western-blot检测CHOP蛋白表达水平,Realtime-PCR检测CHOP mRNA表达水平。P<0.05认为差异具有统计学意义。

结果：

1、HPAEC-CHOP细胞CHOP蛋白表达水平较HPAEC细胞降低大于80%,说明CHOP基因沉默达到预期效果。

2、透射电镜观察内质网形态。Ctrl组以及PBA组HPAEC细胞内质网形态正常,CSE组HPAEC细胞出现内质网肿胀（表现为体积增大和折叠变平变浅）,CSE+PBA组HPAEC细胞内质网肿胀程度较CSE组HPAEC细胞减轻。Ctrl组、PBA组以及CSE+PBA组HPAEC-CHOP细胞内质网形态基本正常;CSE组HPAEC-CHOP细胞内质网无明显肿胀,但是内质网膜电子密度增高。

3、流式细胞仪检测细胞凋亡比例。HPAEC细胞不同处理组相同处理时间比较:PBA组凋亡比例与Ctrl组无差异;CSE组凋亡比例高于Ctrl组和PBA组;CSE+PBA组凋亡比例高于Ctrl组和PBA组,但是低于CSE组。HPAEC细胞不同CSE处理时间组比较,处理12h组高于处理6h组,处理24h组高于处理12h组。HPAEC-CHOP细胞不同处理组相同处理时间比较:PBA组凋亡比例与Ctrl组无差异;CSE组凋亡比例高于Ctrl组和PBA组;CSE+PBA组凋亡比例高于Ctrl组和PBA组,但是低于CSE组。HPAEC-CHOP细胞不同CSE处理时间组比较,凋亡比例无显著性差异。相同处理时间HPAEC-CHOP细胞与HPAEC细胞比较:HPAEC-CHOP细胞CSE组凋亡比例低于HPAEC细胞的CSE组;HPAEC-CHOP细胞CSE+PBA组凋亡比例低于HPAEC细胞的CSE组;HPAEC-CHOP细胞CSE+PBA组凋亡比例低于HPAEC细胞的CSE+PBA组。

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