工业微生物菌种分离筛选的目标产物与核心环节及操作流程！

百欧博伟生物：工业微生物产生菌的分离筛选是微生物资源开发的核心环节，目的是从复杂环境中分离出具有特定代谢功能（如产酶、抗生素、有机酸等）的菌株，并优化其生产性能。以下是详细的步骤和关键点：

一、明确目标与设计实验方案

1、确定目标产物

例如：抗生素、酶类（淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶）、有机酸（柠檬酸、乳酸）、多糖、生物表面活性剂等。

根据产物特性选择筛选模型（如抑菌圈法、显色底物法、产物浓度检测等）。

2、样本来源选择

常规环境：土壤（尤其是富含有机质的土壤）、水体、植物根际、堆肥等。

特殊环境：高温温泉（嗜热菌）、高盐环境（嗜盐菌）、酸性/碱性环境（嗜酸/嗜碱菌）等，以筛选微生物。

二、样本预处理与富集培养

1、物理/化学预处理

加热处理：如分离芽孢杆菌时，80℃水浴10分钟杀死非芽孢菌。

选择性抑制剂：添加抗生素（如抑制真菌）或调整pH（如酸性条件筛选乳酸菌）。

梯度稀释：降低样本复杂度，提高目标菌分离概率。

2、富集培养

使用含特定底物的培养基，促进目标菌生长。

示例：

筛选纤维素降解菌：以羧甲基纤维素为碳源。

筛选产蛋白酶菌：添加酪蛋白为底物，观察透明水解圈。

三、初筛（Primary Screening）

1、平板筛选法

显色反应：

淀粉酶菌：淀粉培养基+碘液染色，透明圈越大酶活性越高。

脂肪酶菌：含橄榄油和罗丹明B的培养基，紫外灯下显荧光晕圈。

抑菌圈法：如抗生素产生菌抑制指示菌（如金黄色葡萄球菌）生长。

2、高通量筛选技术

微流控芯片、荧光标记、流式细胞术等，快速筛选高产菌株。

四、复筛（Secondary Screening）

1、摇瓶发酵与产物定量

对初筛阳性菌进行小规模发酵，检测产物浓度（如HPLC、分光光度法）。

优化培养基成分（碳源、氮源、诱导剂）和培养条件（温度、pH、溶氧）。

2、稳定性测试

连续传代5~10次，观察产物的遗传稳定性。

五、菌种纯化与鉴定

1、纯化方法

平板划线法、稀释涂布法，确保获得单菌落。

2、形态与生理生化鉴定

形态：菌落形态、革兰氏染色、显微镜观察（孢子、鞭毛等）。

生理生化：碳源利用、酶活性（氧化酶、过氧化氢酶）、耐盐性等。

3、分子生物学鉴定

16S rRNA基因测序：确定菌株属种（通用引物27F/1492R）。

功能基因检测：如聚酮合酶基因用于抗生素产生菌鉴定。

六、菌株优化与保藏

1、诱变育种

紫外线、化学诱变剂、ARTP（常压室温等离子体）诱变，结合高通量筛选。

2、基因工程改造

CRISPR-Cas9敲除竞争代谢通路，过表达关键基因。

3、菌种保藏

短期：斜面培养基（4℃保存1~3个月）。

长期：甘油管（-80℃）或冷冻干燥保藏。

七、工业应用评估

1、发酵性能：生长速率、底物转化效率、抗污染能力。

2、经济性：培养基成本、产物提取难度。

3、安全性：是否产毒素、是否属于致病菌（需符合生物安全等级）。

示例：产淀粉酶菌的分离流程

1、采样：面粉厂周边土壤。

2、富集：以可溶性淀粉为碳源的液体培养基，30℃振荡培养48小时。

3、初筛：淀粉琼脂平板，碘液显色后挑选透明圈直径大的菌落。

4、复筛：摇瓶发酵测定酶活（DNS法测还原糖）。

5、鉴定：16S rRNA测序确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

通过系统化的分离筛选流程，结合现代分子技术，可高效获得适用于工业生产的优良菌株。

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