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20005152--illumina Infinium® Omni5-4 v1.2 Kit 用户指南
超高检测通量：可同时检测超过 500 万个遗传变异位点，一次实验即可获取大量的基因组信息，极大地提高了研究效率，适用于大规模的全基因组研究和复杂疾病的多因素分析 。
高准确性与可靠性：经过严格的设计和验证，Infinium 技术具有的准确性和重复性 。通过对多个重复样本的检测验证，该试剂盒的基因型一致性可达 99% 以上，能够为科研结果提供可靠的数据支持。
广泛的位点覆盖：涵盖了国际通用的基因组参考数据库（如 dbSNP、1000 Genomes Project 等）中的大量功能性和常见变异位点，同时也包含了针对特定人群、疾病或研究领域优化的位点，确保对关键遗传信息的全面捕获 。
灵活的应用范围：不仅适用于人类样本的基因分型研究，也可通过适当的调整应用于其他物种的遗传分析 。无论是基础科研、临床研究还是药物研发，都能为研究人员提供有价值的基因组数据。
配套的数据分析工具：Illumina 提供了一系列配套的数据分析软件（如 GenomeStudio、BlueFuse Multi 等），这些软件操作简便，功能强大，可帮助科研人员快速、准确地进行数据处理、基因型分析和结果可视化 。从原始数据的质量控制到复杂的 CNV 分析，都能得到一站式的解决方案。
样本准备：
样本类型：该试剂盒适用于多种样本类型，包括新鲜全血、EDTA 抗凝全血、口腔拭子、FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织等 。但不同样本类型的处理方法有所差异，需根据实际情况选择合适的样本。
DNA 提取：使用高质量的 DNA 提取试剂盒，按照说明书的操作步骤从样本中提取基因组 DNA 。提取后的 DNA 需进行浓度和纯度测定，建议使用 Nanodrop 分光光度计或 Qubit 荧光定量仪检测。DNA 浓度应在 50 - 200 ng/μL 之间，A260/A280 比值应在 1.8 - 2.0 之间，以确保 DNA 质量符合实验要求。
试剂与耗材准备：
试剂盒检查：收到 Illumina Infinium® Omni5-4 v1.2 Kit 后，立即检查试剂盒包装是否完好，确认各试剂组分是否齐全，包括 DNA 处理试剂、杂交试剂、延伸试剂、洗涤缓冲液、芯片等 。查看试剂的有效期，确保在有效期内使用。将试剂盒短暂离心（低速，如 2000 - 3000 rpm，离心 1 - 2 分钟），使附着在管盖上的试剂集中于管底。
其他耗材：准备无菌的 PCR 管、移液器吸头、离心机、振荡混合器、水浴锅、恒温培养箱等实验耗材和设备 。确保所有耗材均为无菌、无核酸酶污染状态，实验设备运行正常。
实验环境准备：在进行实验前，对实验室工作台面进行清洁和消毒，使用 75% 酒精擦拭台面 。确保实验环境温度和湿度稳定，避免环境因素对实验结果产生影响。实验过程中，严格遵守实验室生物安全和无菌操作规范，防止样本污染。
DNA 处理：
亚硫酸氢盐转化（可选，用于甲基化研究或作为预处理步骤）：取适量提取的 DNA 样本，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行亚硫酸氢盐转化 。该过程包括 DNA 变性、亚硫酸氢盐处理、中和及纯化等步骤，将未甲基化的 C 转化为 U，同时保留样本的 DNA 完整性。转化后的 DNA 需进行定量和质量检测，确保转化效率达到 90% 以上。
DNA 片段化与标记：将处理后的 DNA 进行片段化处理，使其成为适合与芯片探针杂交的片段长度 。然后，对 DNA 片段进行标记，通常采用末端标记的方法，在 DNA 片段的末端添加特定的标签，以便后续与芯片探针结合。
杂交：将标记好的 DNA 样本与杂交缓冲液混合均匀，加入到 Infinium® Omni5-4 v1.2 芯片的反应孔中 。将芯片放入杂交炉中，按照设定的温度和时间进行杂交反应（一般为 48 - 72 小时）。在杂交过程中，DNA 片段会与芯片上的探针特异性结合，形成稳定的杂交复合物。
洗涤：杂交完成后，将芯片从杂交炉中取出，放入洗涤工作站中，使用洗涤缓冲液进行多次洗涤 。洗涤过程旨在去除未结合的 DNA 片段和杂质，确保芯片上只保留与探针特异性结合的 DNA。洗涤步骤需严格按照说明书操作，控制洗涤时间和温度，以保证洗涤效果。
单碱基延伸：向芯片反应孔中加入 DNA 聚合酶和带有荧光标记的 ddNTP，进行单碱基延伸反应 。在合适的温度和反应时间下（一般为 37℃孵育 2 - 4 小时），DNA 聚合酶根据目标位点的碱基类型，将对应的 ddNTP 添加到探针上，完成单碱基延伸。
荧光检测：延伸反应结束后，将芯片放入 Illumina iScan 等荧光扫描仪中进行扫描 。扫描仪会根据荧光标记的不同颜色和强度，对每个位点的信号进行检测和记录，生成原始数据文件。
数据导入：将扫描得到的原始数据文件导入 Illumina GenomeStudio 等数据分析软件中 。软件会自动识别数据文件中的信息，并将其转换为可分析的格式。
质量控制：在数据分析前，需对数据进行质量控制 。通过软件中的质控模块，检查样本的整体信号强度、检出率、SNP 分型聚类情况等指标，剔除质量不合格的样本和位点。一般要求样本的检出率大于 95%，SNP 分型聚类清晰，信号强度均匀。
基因型分析：使用软件的基因型分析模块，对经过质量控制的数据进行基因型 calling 。软件会根据荧光信号的强度和颜色组合，自动判断每个位点的基因型，并生成基因型数据表格 。对于不确定的基因型，可通过手动调整聚类边界或参考其他样本的基因型进行修正。
CNV 分析（可选）：如果需要进行拷贝数变异分析，可使用 BlueFuse Multi 等专门的 CNV 分析软件 。将基因型数据导入软件后，通过与参考基因组进行比对，分析样本中目标区域的拷贝数变化情况，并生成 CNV 分析报告。
结果解读与可视化：根据研究目的，对基因型和 CNV 分析结果进行解读 。可使用软件中的可视化工具，生成聚类图、曼哈顿图、热图等，直观展示研究结果。同时，结合生物学背景知识和研究假设，对结果进行深入分析和讨论，挖掘潜在的遗传信息。
试剂与耗材处理：实验结束后，将剩余的试剂按照要求保存于 - 20℃冰箱中，避免反复冻融 。对于已开封的试剂，需尽快使用，并在使用前检查试剂是否有变质或污染的迹象。使用过的耗材（如 PCR 管、吸头、芯片等）属于生物废弃物，应按照实验室生物安全规定进行分类处理，进行高压灭菌或化学消毒后丢弃。
数据存储与备份：将实验数据和分析结果进行妥善存储，建议使用专用的服务器或硬盘进行备份 。同时，对数据进行合理的命名和分类，以便后续查询和使用。为了确保数据的安全性，定期对数据进行备份，并建立数据恢复机制。
样本质量：样本的质量直接影响实验结果的准确性，确保提取的 DNA 浓度和纯度符合要求，避免样本降解和污染 。对于 FFPE 组织样本，由于 DNA 质量可能较差，需特别注意提取方法和质量检测，必要时可进行多次提取和纯化。
试剂使用：严格按照说明书要求的储存条件保存试剂，避免试剂因储存不当而失效 。使用试剂时，应使用无菌的移液器和吸头，避免交叉污染。每次取试剂后，及时将试剂管盖紧，放回冰箱保存。不同批次的试剂可能存在差异，尽量使用同一批次的试剂进行实验，以保证实验结果的一致性。
实验操作：实验过程中，严格遵守操作步骤和时间要求，确保每个步骤的准确性和一致性 。在进行 DNA 处理、杂交、洗涤等操作时，要注意避免样本蒸发和污染。同时，保持实验环境的清洁和稳定，减少外界因素对实验结果的干扰。
数据分析：在数据分析过程中，要注意选择合适的质控标准和分析方法 。对于不确定的结果，需进行进一步的验证和分析。同时，保护数据的隐私和安全，遵守相关的数据管理规定。
样本检出率低：
原因：可能是样本 DNA 质量不佳、DNA 浓度过低、杂交条件不合适、洗涤过度等 。
解决方法：重新检测样本 DNA 的浓度和纯度，确保其符合实验要求；适当增加 DNA 上样量；优化杂交条件，如调整杂交温度、时间和杂交液配方；检查洗涤步骤，减少洗涤次数或降低洗涤强度，避免过度洗涤导致结合的 DNA 丢失 。
SNP 分型聚类不清晰：
原因：可能是荧光信号强度不足、探针设计不合理、样本存在污染、实验操作误差等 。
解决方法：检查荧光扫描仪的参数设置，确保信号检测的准确性；重新评估探针的设计，选择特异性更高的探针；对样本进行污染检测，如检测是否存在外源 DNA 污染；仔细检查实验操作步骤，避免操作误差，如确保试剂添加准确、混合均匀等 。
CNV 分析结果异常：
原因：可能是参考基因组选择不当、数据分析参数设置不合理、样本存在批次效应等 。
解决方法：根据研究物种和样本类型，选择合适的参考基因组；优化 CNV 分析软件的参数设置，如调整阈值、滑动窗口大小等；对样本进行批次效应校正，如使用 ComBat 等软件进行处理 。
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