HCT-15细胞专用培养基的培养操作与主要应用！

一、背景

HCT-15细胞专用培养基可保持HCT-15细胞的生长状态。培养基中已包含HCT-15细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于HCT-15细胞的体外培养。

二、细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

用于水蜡树果实提取物对结肠癌HCT-15细胞的增殖、千移及凋亡诱导因子AIF表达的影响研究：

通过体外实验研究水蜡树果实提取物（Fruit of Ligustrum Obtusifolium Extract,FLOE）对结肠癌HCT-15细胞的增殖、迁移及凋亡诱导因子（Apoptosisi Iducing Fctor,AIF）表达的影响,探讨其可能的作用机制,为中药在结肠癌治疗中的研发及AIF应用于结肠癌治疗提供更多的理论依据。

方法：体外培养结肠癌细胞株HCT-15,取对数期细胞用于实验。将FLOE用不培养基RPMI-1640稀释成不同浓度:0μg/ml（对照组）、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组,并用RPMI-1640不培养基稀释75%酒精（20μg/ml）,设置阴性对照。

采用普通光学显微镜观察在不同浓度药物分别处理24h、48h、72h、96h后细胞形态学变化,并在显微镜下计算贴壁细胞数量。采用MTS法检测不同浓度药物分别处理24h、48h、72h、96h后,对HCT-15细胞存活率的影响。采用集落实验检测不同浓度FLOE对结肠癌HCT-15细胞生存能力的影响;划痕实验检测在不同浓度药物处理后,对HCT-15细胞迁移能力的影响。

采用Western bolt法检测在不同浓度药物作用48h后,对HC15细胞凋亡相关蛋白及AIF表达的影响。结果:随着FLOE药物浓度的增高及作用时间的延长,HCT-15细胞伸展变差、细胞间隙增大、空泡化、细胞漂浮,细胞计数发现贴壁细胞也随之减少。MTS结果表明与对照组相比FLOE处理后的细胞存活率降低（P<0.05）,且呈时间及浓度依赖性。

划痕实验结果表明与对照组相比FLOE处理后的细胞划痕区域相对宽度较宽（P<0.05）。集落实验结果表明FLOE处理后细胞集落形成数量明显降低,与对照组相比集落抑制率有统计学意义（P<0.05）。Western bolt实验结果表明随着FLOE浓度的增高,Survivin、Mcl-1蛋白表达水平明显降低,而凋亡诱导因子AIF表达增加。

结论：水蜡树果实提取物能抑制HCT-15细胞增殖及迁移,且呈浓度及时间依赖性。其机制可能通过下调抗凋亡蛋白的表达及上调凋亡诱导因子AIF的表达实现。

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