脂肪组织中分离巨噬细胞的实验步骤与注意事项有哪些？

一、实验步骤

1、分离

用PBS清洗脂肪组织，并将组织放在冰上的培养皿中，用剪刀将组织切成小块（约3-5mm）。

将切碎的组织转移到含有7mL冰冷消化缓冲液的10mL圆底管中，此操作需一直保持在冰上。对于>1g的脂肪，将组织切碎并转移到含有10mL冰冷消化缓冲液的50mL锥形管中。

加入1mL（如脂肪组织重量>1g则可以增加至1.5mL）10× 胶原酶缓冲液，并加入消化缓冲液使得胶原酶的最终浓度为1mg/mL。

在37°C下孵育半小时，且使试管剧烈摇晃。每10分钟大力摇动试管，可获得更高的细胞产量。30分钟后，取10µL产物进行显微镜观察，此时，脂肪细胞应显示为大的单细胞，白细胞和其他基质细胞会小得多。如果白细胞仍附着在脂肪细胞上，则应继续消化；如果没有，请继续下一步。

消化后，将EDTA添加到10 mM的最终浓度，并在37°C下再孵育10分钟。

2、过滤

用 PBS预湿100 µm尼龙过滤器，然后放置在50mL锥形管上。使用移液管，将前述样本的细胞沉淀先转移到过滤器上过滤，然后再过滤含有脂肪细胞的上层。

加入10 ml FACS 缓冲液轻轻清洗过滤器两次。

3、离心

在4 °C下以500×g 离心10分钟以分离脂肪细胞和巨噬细胞。离心后，脂肪细胞在顶部形成白色层，而巨噬细胞等其它细胞在管底部形成红色或白色沉淀。

轻轻吸出并丢弃脂肪细胞和上清液。此时，含有巨噬细胞的团块很容易受到干扰，因此应格外小心。

4、获取巨噬细胞

通过轻弹试管将沉淀重悬于0.5 mL红细胞裂解液中。在室温下孵育5分钟，偶尔轻轻摇晃。

通过添加5 mL FACS缓冲液，中和红细胞裂解作用。

在4 °C下以500×g 离心10分钟。

在3—5 mL FACS缓冲液中重悬细胞沉淀并在冰上孵育。

5、巨噬细胞计数

将10 µL每个样品1:1与台盼蓝溶液混合。使用血细胞计数板仔细计数活细胞。根据计数得到的细胞数量，结合获得的样本总体积，可计算出每份脂肪组织巨噬细胞产量。典型的产量：瘦小鼠一般为1-3×1000000个细胞/g脂肪，肥胖小鼠一般为2-5×1000000个细胞/g脂肪。

二、注意事项

1、尽可能切碎组织，在消化过程中频繁手动摇动增加接触面积。

2、胶原酶消化脂肪组织时，碎组织大小、摇动强度和孵育时间是关键参数，应对其进行优化，以限度地提高从脂肪提取巨噬细胞的产量。

3、胶原酶的消化时间应根据每批胶原酶分别进行优化。增加胶原酶缓冲液中的孵育时间，尤其是超过1小时，会显著降低细胞产量并增加细胞死亡几率。

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