构建重组蛋白屡次失败的原因

构建重组蛋白屡次失败的原因：分为以下几点

一、重组蛋白表达的原理

重组蛋白表达是利用DNA重组技术，将目标基因（外源基因）导入宿主细胞中，并通过宿主细胞的生物机制使其表达出特定蛋白。其主要步骤包括：

基因克隆：将目标基因经过PCR扩增后，与表达载体连接，形成重组质粒。

转染或转化：将重组质粒导入宿主细胞中，可以使用化学方法、电穿孔或者嗜热菌等方式进行转染或转化。

表达蛋白：重组质粒进入宿主细胞后，融合到宿主细胞的染色体中，随后遵循细胞的转录和翻译机制，表达出目标蛋白。

二、常见的重组蛋白表达系统

大肠杆菌表达系统：大肠杆菌是常用的重组蛋白表达宿主细胞之一。其优点在于生长快速、易于培养，并且能够产生大量的蛋白。此外，大肠杆菌的遗传工具和代谢途径也被广泛研究，提供了便利。

酵母表达系统：酵母表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。这些酵母细胞具有真核细胞的特点，能够进行正确的蛋白折叠和修饰。同时，酵母细胞也可以进行大规模培养和高表达，适用于一些复杂蛋白的表达。

昆虫细胞表达系统：昆虫细胞表达系统常用于大规模蛋白表达。昆虫细胞具有真核细胞的优势，能够对蛋白进行正确的折叠和修饰，适合于表达大量需求复杂结构的重组蛋白。

哺乳动物细胞表达系统：哺乳动物细胞的表达系统可用于高效表达复杂蛋白和进行蛋白质研究。哺乳动物细胞具有真核细胞特点，能够进行正确的蛋白质修饰和折叠，并且在一些特殊情况下需要考虑到人类蛋白的免疫原性。

三、重组蛋白生产步骤

细胞中有两个蛋白生产阶段：转录和翻译，被称为分子生物学的中心法则。换言之，转录和翻译步骤属于重组蛋白表达步骤。

为了生产重组蛋白，基因被分离并克隆到表达载体中。重组蛋白的生产需要蛋白表达系统、蛋白纯化系统和蛋白识别系统。

获取重组蛋白的基本步骤：

1.目标基因的扩增。

2.插入克隆载体。

3.亚克隆到表达载体中。

4.转化到蛋白表达宿主中(细菌(大肠杆菌)、酵母细胞、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统)。

5.重组蛋白鉴定试验(Western blot或荧光)

6.大规模生产。(大规模发酵)

7.分离和纯化。