产品简介：

eccDNA 就是 extrachromosomal circular DNA（染色体外环状 DNA）的简称，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外的环状 DNA。长度主要分布在 0.1-5Kb 之间，99%小于 25Kb。近年来研究表明，eccDNA 普遍存在于包括酵母在内得真核细胞中，因此其进行深入研究具有重要的意义。但是纯化 eccDNA，尤其是测序级的 eccDNA 一直是个难题，为此本公司开发了本产品。

产品特点：

1.即开即用，直接用培养的酵母细胞为起始材料，最后得到纯化的 eccDNA， 用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。

2.基于沉淀法，不用过柱法和磁珠法，减少短的 eccDNA 的丢失。

3.含专门的酶切消化线状 DNA 的步骤，降低线状 DNA 的干扰。

4.本产品含荧光染料法滚环扩增试剂盒，进一步富集 eccDNA。

5.本产品一次可以处理约 5×10E8 个培养的酵母细胞。

6.本产品足够 25 次 eccDNA 的纯化和扩增实验。

7.酵母 eccDNA 纯化及扩增试剂盒只能用于科研。

产品参数：

名称规格包装

酵母 eccDNA 纯化溶液 A250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 纯化溶液 B250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 纯化溶液 C250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 纯化溶液 D250mL250mL 棕色玻璃瓶

酵母 eccDNA 纯化溶液 E250mL×2250mL 本色瓶

酸洗玻璃珠（直径 800um）10g10mL 本色瓶

线状 DNA 消化缓冲液1.5mL1.5mL 绿盖管

线状 DNA 消化酶15uL0.5mL 红盖管

环状 DNA RCA 试剂盒25 次/1 套五孔盒

使用手册1 份无

运输及保存

常温运输和保存，但三个低温成分：线状 DNA 消化缓冲液、线状 DNA 消化酶

和环状 DNA RCA 试剂盒需要低温运输和-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

75%乙醇，超纯水

使用方法：

一：eccDNA 粗提（粗体液中含有线状 DNA，线粒体 DNA 和 eccDNA）

1.培养酵母细胞：按常规方法离心沉淀 5×10E6 个酵母细胞。

2.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 A 后重悬细胞，加入玻璃珠（800nm）0.1g，涡旋震荡 3 分钟。

3.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 B，轻柔颠倒 10 次。

4.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 C，轻柔颠倒 10 次。

5.常温离心 7500g 10 分钟，此步将沉淀下大部分染色体 DNA 和蛋白质。

6.将上清液体转移到新的 10mL 离心管中。

7.加入等体积的酵母 eccDNA 提取溶液 D，涡旋震荡 3 分钟。

8.常温离心 7500g 5 分钟，蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含 DNA 的上清转移到新的离心管中。

9.重复第 11-12 步一次。

10.常温离心 7500g 5 分钟，残留蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含 DNA 的上清转移到新的离心管中。

11.加入 2 倍体积的酵母 eccDNA 提取溶液 E，颠倒混匀后，常温离心 7500g 10 分钟。

12.加入自备的 10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心 7500g 3 分钟。

13.吸弃上清后，再短暂离心，再吸弃上清。沉淀即含有酵母 eccDNA 的粗提物。

14.开盖短暂放置在室温 3 分钟。

15.加入 50uL 1×线状 DNA 消化缓冲液，再加入 1uL 线状 DNA 消化酶，轻柔吹打混匀。

16.37C 保温 2 小时。

17.加入酵母 eccDNA 提取溶液 D，充分涡旋震荡混匀。

18.常温离心 7500g 5 分钟，将上清液转移到新的离心管中。

19.加入 2 倍体积的酵母 eccDNA 提取溶液 E，颠倒混匀。

20.常温离心 4500g 10 分钟。

21.加入 10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心 4500g 3 分钟。

22.吸弃上清，短暂离心，再吸弃上清。

23.加入 20uL 超纯水，吹打溶解酵母 eccDNA 沉淀。由于有助沉剂，所以沉淀可见。

24.取 5uL 进行 RCA 扩增，剩余的放-20℃长期保存。

25.RCA 扩增：在两个 PCR 管中，分别加入加入 5uL eccDNA 模板（样品管）

和 5uL 超纯水（阴性对照管），再分别加 10uL 2×RCA 扩增液，2uL 20×随机引物 V2.0，2uL 超纯水，共 19uL。 95℃ 5 分钟变性，立即放冰上，再分别加入 1uL 的phi39 DNA 聚合酶，30℃保温 16 小时。如果使用荧光定量 PCR仪保温，则设置每 10 分钟一个循环，温度 30℃，每次循环采集一次 SYBR 通道的荧光信号。样本管应该有标准的扩增曲线，而阴性对照管将没有扩增  曲线。

26.  70℃10 分钟变性灭活酶，所得扩增后的 DNA 可以用于各种后续实验。

选择我们的酵母 eccDNA 纯化及扩增试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！