产品简介：

本试剂盒用于从革兰氏阳性（G+）细菌中小量制备质粒 DNA。本产品是经过精心改良后的碱变性法质粒 DNA 纯化试剂盒，其原理是菌体经溶菌-酶破壁， 将破壁后的菌体用碱使基因组 DNA 和质粒 DNA 全部变性，经酸中和后的质粒DNA 可以快速复性，基因组 DNA 不能快速复性，通过离心可有效去除基因组DNA。除去基因组 DNA 后的含质粒 DNA 的上清用离心吸附柱吸附质粒 DNA， 洗去杂质，即可得到纯化的质粒 DNA。

产品特点：

1.简单快捷，整个实验在 40 分钟左右完成。

2.不需要预平衡离心吸附柱。

3.通用洗柱液即开即用，不需要用户额外加乙醇。

4.溶液 B 中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。

5.产量高，一次可以处理 1-4mL 过夜培养的 G+菌液，每毫升过夜培养的 G+细菌可以提取到 2-5μg/mL，纯化后质粒 DNA 的浓度取决于质粒的拷贝数

6.纯度高，采用本试剂盒提取的质粒 OD 比值在 1.8-2.0 之间，可以直接用于酶切、转化、测序及 PCR 等。

7.本产品足够 50 次微量提取。

8.革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化试剂盒(过柱法)只可用于科研。

产品参数：

成分规格包装

革兰氏阳性细菌质粒 DNA

纯化溶液 A13 mL15 mL 本色瓶

革兰氏阳性细菌质粒 DNA

纯化溶液 B13 mL15 mL 棕色瓶

革兰氏阳性细菌质粒 DNA 纯化溶液 C18 mL30 mL 本色瓶

溶菌-酶干粉（20KU/mg）250 mg2.0 mL 黄盖管

RNase A 溶液，10mg/mL0.6 mL2.0 mL 本盖管

通用洗柱液50 mL60 mL 本色瓶

DNA 洗脱液

（基因组 DNA 专用）10 mL10 mL 本色瓶

离心吸附柱50 套塑料袋

使用手册1 份无

运输及保存

常温运输和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

1.5 mL 塑料离心管。

使用方法：

1.从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养 12-16 小时

（摇床转速 200-300）。注意：建议使用 LB 培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒 DNA 的质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒 DNA 浓度降低。

2.用 1.5mL 离心管收集 1-4mL 过夜培养饱和菌液，室温 12,000rpm 离心 1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。

3.第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部 RNase A 溶液加入到革兰氏阳性细菌质粒 DNA 纯化溶液 A（简称溶液 A，下同）中，摇匀后再取用， 未用完的溶液 A 放 4℃保存。

4.加入 250μL 溶液 A 到第 2 步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。注意：细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完-全混匀。

5.加入大约 5mg 溶菌-酶干粉到细菌悬液中（用 0.1mg 精度的分析天平称量），轻柔颠倒混匀后室温放置 10 分钟破裂细胞壁。

6.加入 250μL 革兰氏阳性细菌质粒 DNA 纯化溶液 B（下面简称溶液 B，如果溶液 B 在低温放置产生沉淀，须 37℃加热溶解后冷却到室温方可使用）， 温和颠倒 4-6 次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。注意：千万不要剧烈振荡，否则基因组 DNA 断裂产生的片段非常容易污染质粒 DNA。溶液 B 用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸， 中和溶液 B 中的碱，降低其效率。如果溶液 B 颜色不是蓝色，则表示变质， 应该弃之不用并且跟厂家联系。

7.冰上放置不超过 5 分钟。注意：冰上放置不要超过 5 分钟，否则质粒 DNA 会有碱损伤。

8.加入 350μL 冰上预冷的革兰氏阳性细菌质粒 DNA 纯化溶液 C（下面简称溶液 C），温和反复颠倒 4-6 次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。

9.冰上放置至少 5 分钟让质粒 DNA 复性。不能短于 5 分钟，一般 10 分钟。

10.12,000rpm 离心 3 分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。如果此步的离心在 4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。

11.静置 2 分钟以让质粒 DNA 与离心吸附柱充分结合。

12.室温 12,000rpm 离心 1 分钟，弃收集管中的废液。

13.加入 500μL 的通用洗柱液到离心吸附柱中，室温 12,000rpm 离心 1 分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要将盖拧紧存放， 否则乙醇会挥发。

14.重复上步 1 次。

15.室温 12,000rpm 离心 1 分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响 DNA 的后续使用（如残留乙醇使 DNA 溶液在电泳上样时不能沉淀到加样孔中）。

16.将离心吸附柱置于一个新的 1.5mL 塑料离心管中，加入 30-100μL 65-80℃预热的 DNA 洗脱液（基因组 DNA 专用），室温放置 2 分钟。

17.室温 12,000rpm 离心 1 分钟，离心管底溶液即质粒 DNA 溶液。

选择我们的革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化试剂盒(过柱法)，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！