产品简介：

本试剂盒采用E.coli polyA聚合酶对miRNA加尾，然后用特异引物进行逆转录，最后用荧光定量PCR试剂盒进行定量检测，其原理示意图如下：

产品特点：

1.两步法（加尾-逆转录、染料法 qPCR），一步完成加尾-逆转录，然后检测多个 miRNA 靶分子。一次加尾-逆转录反应得到的 cDNA 可以做上百次 PCR。

2.直接用总 RNA 为模板，不需要专门纯化 miRNA，简单快捷。

3.检测灵敏度可以达到几百个拷贝/反应。

4.能区分有 2-3 个碱基不同的 miRNA。

5.既可以定性，也可以定量。定量时线性范围至少有 5 个数量级，但需要自备标准品。

6.既可以用总 RNA 为模板，也可以用总 miRNA 为模板。

7.用户需要自备 miRNA 专一性的一条 PCR 上游引物。

8.本产品足够 25 次 20uL 体系的加尾和逆转录反应，100 次 20uL 体系的染料法qPCR。

9.miRNA 染料法qRT-PCR试剂盒（polyA加尾法）只能用于科研。

产品参数：

成分规格包装材料

加尾和逆转录 Mix

（含 dNTP 和 ATP）150 μL0.5mL 绿盖管

miRNA-polyA RT 引物干粉0.5mL 本色管

E.coli polyA 聚合酶和

M-MLV 逆转录酶混合液40 μL0.5mL 红盖管

miRNA PCR 通用下游引物  干粉0.5mL 黄色管

2×SYBR PCR MasterMix1 mL0.5mL 棕色管

超纯水1 mL2.0mL 蓝盖管

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

总 RNA、miRNA 专一性上游引物（5pmol/μL in 水中）

使用方法：

一、设计、合成和分析自备的 miRNA 专一性上游引物

1.本试剂盒需要用户自行设计一条 miRNA 靶分子专一性的上游引物跟试剂盒提供的通用引物共同使用，用超纯水稀释到 5pmol/μL 待用。

2.miRNA 专一性上游引物的 Tm 值决定后续 PCR 的复性温度，非常重要，故

必须准确。可以通过网上的在线分析软件（如 oligoanalyzer）计算 Tm，但最好实验测定，做法是将 100pmol miRNA 专一性上游引物和等量的互补引物

（不是下游引物）在 20μL 的本试剂盒提供的 2×SYBR PCR MasterMix 反应体系中混合（参考第 9 步，只是不加模板，其他成分都加），直接进行溶解曲线分析，测出在本试剂盒提供的反应体系中的 Tm 值。当软件计算的 Tm 值和实验测试的 Tm 值有差异时，以后者为准。

3.miRNA 专一性上游引物最好在 3 端比 miRNA 短几个碱基。

4.可以选择一个所研究物种的 5.8S rRNA 作为内参，设计一条 5.8S rRNA 专一性的引物，同时做平行实验。

二、准备总 RNA

5.用自选方法和试剂纯化总 RNA，测定其浓度，最后用超纯水将其稀释到100ng/μL。总 RNA 样品中残留的 DNA 污染由于并没有下游通用引物

（miRNA-polyA RT 引物）的结合位点，所以一般不会干扰基于本方法的

miRNA PCR 检测。

三、加尾及逆转录反应

6.按下表设置 RNA 加尾和逆转录反应，以 1 个样品为例：

7.37℃保温 1 小时。

8.加入 190μL 超纯水使得总体积为 200μL（稀释 20 倍），此样品将作为 cDNA模板用于 PCR。未用完的 cDNA 20 倍稀释样品可以放-20℃至少两年以上。

二、染料法 qPCR

9.按下表设置染料法 qPCR 反应，最好每个反应设置 3 个重复：

10.建议反应程序设置如下：

11.分析溶解曲线分析所得 Tm（在 70-80℃之间一般表示扩增是特异的），分析Ct 值，分析标准曲线的斜率和 R2（如果用阳性对照做了标准曲线反应的话）。

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