单细胞测试分析系统

单细胞测试分析系统      流式单细胞力学仪器

德国Zellmechanik公司

AcCellerator型

单细胞力学流式分析系统

研发背景

1 研究细胞力学在临床有什么意义？ 如何区分不同果实的成熟度？

解决方案：施加适当的力并感应水果的机械特性，将清楚地向您展示成熟和过熟的猕猴桃之间的区别。

这是否也适用于较小的水果组织碎片？如果我们下降到单细胞水平怎么办？

细胞的机械特性由功能上重要的细胞成分控制，例如细胞骨架。它们构成了一种新兴的无标记生物标志物，可以直接了解细胞功能或功能障碍。因此，机械特性有助于理解和评估药物治疗效果、免疫细胞活化、干细胞分化、癌症预后或培养细胞的状态和质量的评估。

   细胞变形能力与细胞的状况和功能相关。

   无需标记即可评估细胞变形能力。

   应用潜力巨大。

细胞力学构成了研究从发育到疾病的主题的关键科学目标。

2 为什么采用单细胞流式分析？

Jochen Guck 教授在德累斯顿工业大学使用 AFM 和光学拉伸来揭示细胞力学与细胞功能（或功能障碍）之间的相关性。这些方法的一个主要障碍是低通量（多 100 个细胞/小时）。测量过程为：找到一个细胞，停止施力，整个实验结束后释放细胞，分析测量参数。为了克服耗时的步骤，于是他们开发了一种使用具有连续力和动态分析的连续流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右实施了这个想法。从那时起，已经发表了许多具有高影响力的科学论文，并且技术开始普及。

现在可以同时测量细胞的物理特性和荧光信号 (RT-FDC)，从而可以将细胞的物理特性与细胞生物学的黄金标准（荧光流式细胞术）进行比较和关联。近还可以沿通道动态跟踪细胞变形并研究变形的时间相关动力学 (dRT-DC)。

技术原理

1 如何高速的压缩单个细胞？

为了产生确定的力，孤立的细胞被泵送通过横截面略大于细胞横截面的微通道。周围流体的压力梯度产生流动剖面并使细胞流体动力学变形。流体的流速和粘度控制作用在细胞上的力。

细胞可以通过流体动力变形。

力由流速和粘度控制。

较软的细胞显示较大的变形。

RT-DC 中的“实时"来自于拍摄图像时对细胞轮廓的即时分析。

细胞面积、高度、宽度、纵横比等的立即计算允许对数据进行即时观察和选通。

该算法还计算细胞的亮度和亮度偏差等参数，从而深入了解形态学特性。

系统保存每个检测到的事件图像，可以轻松查看异常值是碎片还是您正在寻找的稀有细胞。

3 如何表征力进而计算杨氏模量？

用于高通量细胞变形测量的微流体方法的比较

细胞的机械表型是其状态和功能的固有生物物理标记，在基础和应用生物学研究中有许多应用。基于微流体的方法使单细胞机械表型分析的吞吐量可与流式细胞术相媲美。在这里，我们提出了一项标准化的跨实验室研究，比较了三种基于微流体的测量细胞机械表型的方法：基于收缩的变形细胞术 (cDC)、剪切流变形细胞术 (sDC) 和拉伸流变形细胞术 (xDC)。所有三种方法都检测由暴露于改变的渗透压引起的细胞变形性变化。然而，仅在 cDC 和 sDC 中检测到 latrunculin B 诱导的肌动蛋白分解后的剂量依赖性变形能力增加，这表明当将细胞暴露于 xDC 施加的更高应变率时，肌动蛋白细胞骨架以外的细胞成分主导反应。这里提出的直接比较进一步加深了我们对不同变形性细胞术方法的适用性的理解，并为解释使用不同平台执行的变形性测量提供了背景。

实时变形细胞仪：动态细胞机械表型分析

我们引入了实时变形细胞仪 (RT-DC)，用于对大量细胞（>100,000 个细胞）进行连续细胞力学表征，分析速率大于 100 个细胞/秒。RT-DC 对细胞骨架的改变很敏感，可以区分细胞周期阶段，跟踪干细胞分化成不同的谱系，并通过其机械指纹识别全血中的细胞群。该技术为流式细胞术增加了一个新的无标记维度，在生物学、生物技术和医学中具有多种应用。

对干细胞衍生红细胞的机械特性进行高通量评估，以进行细胞下游加工

每年，在 176 个国家的 13000 多个血液中心收集了大约 1.125 亿次献血。然而，世界卫生组织每年都会报告供输血使用的安全献血短缺，这主要是由于有资格献血的人数减少以及血液长期储存的技术限制。因此，迫切需要易于管理的红细胞 (RBC) 替代来源，其中一种选择是用干细胞制造它们。Giarratana等人在 2011 年将人造红细胞 (mRBC) 积极验证为潜在的临床产品。已经使用胚胎干细胞在体外产生了潜在的可输血红细胞，诱导多能干细胞，来自骨髓或脐带血的 CD34+ 细胞，以及近一种永生化的成人红细胞系（布里斯托红系成人 BEL-A ) . 然而，目前使用的差异化协议并不是 100% 有效的。具体来说，该协议的终产品是一种异质细胞混合物，不仅包含功能齐全的去核 mRBC，还包含在去核过程中排出的自由浮动核和未分化的有核细胞。残留的干细胞、部分分化的细胞和细胞核的存在，如果注射到患者体内会带来健康风险，因此对于 mRBC 和其他细胞疗法而言，必须通过开发适当的纯化程序来缓解这一严重问题. 传统上，靶细胞分离是通过荧光激活细胞分选 (FACS) 和磁激活细胞分选 (MACS) 进行的。这两种技术都非常具体，因为它们利用分子生物标志物，但需要添加昂贵的修饰剂，如抗体或 DNA 染色剂，以及单独的质量控制过程。此外，这些技术的通量是有限的（例如，本研究中使用的 FACS 仪器每小时10⁷ 个细胞），工业上可行的技术需要具有成本效益、自动化和可扩展的方法. 文献中提出了各种无标记方法，但尚未达到商业测试阶段：声泳、磁泳、光学方和被动分选。被动分选（例如惯性聚焦、夹流分级、确定性横向位移和过滤）利用了设备设计的特性，并且除了液体泵送系统之外，它们不需要任何其他外力。这些系统具有许多潜在优势，例如减少样品处理步骤的数量（例如. 通过减少染色/洗涤步骤），相对高的通量和效率（> 90%）。然而，在这种类型的系统中，分类纯粹是由内源性细胞特性（如大小和可变形性）促进的，需要进一步的证据来量化细胞机械类型，以克服目前缺乏对例如 mRBC 机械特性34的知识，并确定潜在的基于机械型的分类。变形性正在成为一种新的同质性标记，可用于识别复杂细胞样本中的亚群，例如 mRBC. 然而，虽然定性观察已经注意到整个 CD34+ 细胞分化方案中的表型变化，但对其机械表型变化知之甚少。本文报告了对这些变化的次广泛的定量分析，结合了高通量微流体和传统的生物物理表征。具体来说，我们次表征了脐带血 CD34+在体外进行的机械分型分化为红细胞，重点关注四个关键阶段。收集的数据使用实时变形细胞仪 (RT-DC)、原子力显微镜 (AFM) 和明场/荧光成像来确定去核细胞、有核细胞和自由浮动细胞核的大小和可变形性。此外，对细胞核和细胞骨架蛋白进行染色，以研究这些因素对观察到的机械典型变化的潜在贡献。